[發明專利]一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法

無效

• 申請號: 201210480145.7
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102965331A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 張志峰;晏萌;季愛昌;畢穎
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，其特征在于，該培養方法包括以下步驟：

將單個櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞均勻分布在含有0.5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液的直徑為35毫米細胞培養皿中，并放置到20-23℃的生化培養箱中培養，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞；

根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，挑取出來實現早期傳代；

當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。

2.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。

3.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基由L15基礎培養基、5％胎牛血清、1％櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素、100微克/毫升鏈霉素構成。

4.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟五，當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養的實現方法為：

當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，用移液管輕輕吹打或用細胞刮刀刮取獲得解離的單個細胞，在1000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細胞培養瓶中完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。

5.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，體外培養的細胞取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔輪幼蟲、D型幼蟲的細胞，同時該培養方法也可應用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細胞的培養中。

6.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞時，在4℃下培養1-2天，原代培養的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞可存活且可抑制細菌污染，再轉到17-25℃培養箱中，細胞也可實現穩定傳代培養。

7.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，在櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞培養早期，使用高濃度的青鏈霉素雙抗液，青霉素濃度為2500單位/毫升至25000單位/毫升，鏈霉素濃度為2500微克/毫升至25000微克/毫升鏈霉素。

8.如權利要求3所述的培養方法，其特征在于，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基中添加物的最寬范圍：胎牛血清添加量2％-20％，扇貝血清1％-10％，青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。