[發(fā)明專利]GS-DHFRmut雙基因篩選表達(dá)載體、制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210476722.5
• 申請(qǐng)日: 2012-11-22
• 公開（公告）號(hào): CN103468742A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐霆;郭康平;逄敏潔;楊東;汪皛皛;李倩;須濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/64;C12N15/66
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種真核表達(dá)載體、制備方法及應(yīng)用，具體是GS-DHFR^mut雙基因篩選表達(dá)載體及其制備與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

目前以哺乳動(dòng)物細(xì)胞株為代表的真核表達(dá)系統(tǒng)的研發(fā)是生物制藥發(fā)展的趨勢(shì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由于具有精確的轉(zhuǎn)錄后加工，翻譯及修飾(糖基化、酰胺化、磷酸化及二硫鍵的形成等)，同時(shí)外源蛋白的表達(dá)水平是細(xì)胞工程發(fā)展的重要因素。外源基因的擴(kuò)增是提高外源蛋白表達(dá)水平的重要策略之一。目前為止，廣泛應(yīng)用于工業(yè)的基因擴(kuò)增系統(tǒng)有GS(谷氨酰胺合成酶)基因擴(kuò)增系統(tǒng)和DHFR(二氫葉酸還原酶)基因擴(kuò)增系統(tǒng)。?

GS基因擴(kuò)增系統(tǒng)是利用谷氨酰胺合成酶抑制物(Methioninesulphoximine，MSX)在沒有谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下使GS基因及與之相連的外源基因擴(kuò)增，達(dá)到提高外源蛋白表達(dá)水平的目的。(Bebbiington?CR，RennerG，Thomson?S?et?al.Biotechnology，1992；10(2)；169-175.)。DHFR基因擴(kuò)增系統(tǒng)通過選擇DHFR缺陷型的CHO細(xì)胞株作為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染DHFR標(biāo)記的表達(dá)載體到DHFR-細(xì)胞株中，通過不斷提高M(jìn)TX的濃度來篩選高表達(dá)克隆細(xì)胞株。已有文章指出，用不同MTX加壓篩選，表達(dá)載體內(nèi)的DHRF標(biāo)記基因4下游定位的基因同時(shí)擴(kuò)增(Kaufman?et?al.Mol?Cell?Biol.1985；5(7)；1750-1759)。此外也有報(bào)道，分離到突變的高表達(dá)DHFR基因可以在非DHFR缺陷型的宿主細(xì)胞中作標(biāo)記篩選基因，用DHFR^mut基因在CHOK1細(xì)胞株中表達(dá)，通過不同濃度的MTX加壓篩選來提高外源蛋白的表達(dá)水平(Christian?C，Renner?G，Arthur?D?et?al.Biochemistry，1983；80(12)；2495-2499.)。?

然而這種篩選系統(tǒng)要求使用特殊的基因缺陷型細(xì)胞，具有一定的局限性。Levinson小組的科學(xué)家(Christlan?C，Renner?G，Arthur?D?et?al.Biochemistry，1983；80(12)；2495-2499.)自小鼠細(xì)胞庫中分離篩選到了一種突變的DHFR蛋白，DHFRmut。該蛋白位于其活性抑制位點(diǎn)處的第22位氨基酸由野生型的亮氨酸突變?yōu)榫彼幔瑥亩蟠蠼档土似渑c抑制毒素MTX的結(jié)合力。這一突變一方面保留了DHFRmut正常的酶活，另一方面則將DHFRmut對(duì)MTX的抗性提高了約兩個(gè)數(shù)量級(jí)。Levinson小組還進(jìn)一步考察了DHFRmut重組基因轉(zhuǎn)染DHFR缺失型細(xì)胞后的表現(xiàn)，并就其對(duì)MTX的耐受濃度與DHFR+細(xì)胞株(如CHO-K1細(xì)胞株)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)DHFRmut不但可以挽救DHFR缺失型細(xì)胞的MTX敏感現(xiàn)象，更能將其對(duì)MTX的耐受濃度進(jìn)一步提高，甚至比帶有野生型DHFR基因的細(xì)胞還要高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。這一結(jié)果為隨后利用該突變的DHFR在非DHFR缺陷型的宿主細(xì)胞中使用DHFR外源基因擴(kuò)增系統(tǒng)提供了思路。在如CHO-K1等非DHFR缺陷型的宿主細(xì)胞中，以DHFR^mut基因作為標(biāo)記篩選基因，，通過不同濃度的MTX加壓篩選來提高外源蛋白的表達(dá)水平。這一應(yīng)用將大大擴(kuò)大DHFR篩選系統(tǒng)使用宿主細(xì)胞株的范圍。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種GS-DHFR^mut雙標(biāo)記基因表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)，這個(gè)基因擴(kuò)增表達(dá)系統(tǒng)集合了GS系統(tǒng)和DHFR^mut系統(tǒng)兩個(gè)篩選系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，也克服了DHFR系統(tǒng)要求DHFR缺陷型細(xì)胞做轉(zhuǎn)染的缺點(diǎn)。同時(shí)應(yīng)用GS-DHFR^mut雙標(biāo)記基因表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)比單獨(dú)用GS表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白表達(dá)水平提高了50～100倍。?

一種GS-DHFR^mut雙標(biāo)記基因的真核表達(dá)載體，其特征在于，含有外源基因啟動(dòng)子，5’-UTR序列，外源基因插入位點(diǎn)，PolyA外源基因表達(dá)終止信號(hào)，控制的谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)的啟動(dòng)子及谷氨酰胺合成酶基因本身，以及控制的突變的二氫葉酸還原酶基因表達(dá)的啟動(dòng)子及突變的二氫葉酸還原酶基因本身。兩個(gè)篩選基因下游均帶有PolyA信號(hào)序列。所述的GS-DHFR^mut雙標(biāo)記基因的真核表達(dá)載體，具體的突變的二氫葉酸還原酶基因具有Seq?ID?No.1所示的核苷酸序列。?