[發明專利]GS-DHFRmut雙基因篩選表達載體、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201210476722.5
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN103468742A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 徐霆;郭康平;逄敏潔;楊東;汪皛皛;李倩;須濤
• 申請（專利權）人: 蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;C12N15/66
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1.一種GS-DHFR^mut雙標記基因的真核表達載體，其特征在于含有控制谷氨酰胺合成酶基因表達的啟動子及谷氨酰胺合成酶基因，以及控制突變的二氫葉酸還原酶基因表達的啟動子及突變的二氫葉酸還原酶基因，兩個篩選基因下游均帶有PolyA信號序列。

2.根據權利要求1所述的真核表達載體，其特征在于其所述的突變的二氫葉酸還原酶基因具有序列1所示的核苷酸序列。

3.根據權利要求1所述的真核表達載體，其特征在于用于構建所述表達載體的載體骨架為pEE12.4。

4.根據權利要求1所述的真核表達載體，其特征在于所述的控制谷氨酰胺合成酶基因表達和控制突變的二氫葉酸還原酶基因表達的啟動子為SV40啟動子。

5.權利要求1到4任一所述的表達載體的制備方法，包含以下步驟：將突變的二氫葉酸還原酶基因插入在pEE12.4的MluI位點，或是其他位于GS基因下游序列中的限制性內切酶位點，其中二氫葉酸還原酶基因上游有SV40啟動子，下游有SV40-PolyA信號序列。

6.權利要求1到5任一所述的真核表達載體的應用，所述的表達載體用于單個外源基因或多個外源基因的表達。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述的用于單個外源基因表達的步驟為：在外源基因插入位點插入目的外源基因，然后轉入宿主細胞得到轉化細胞；在基礎培養基中添加葉酸類似物甲喋呤和谷氨酰胺合成酶抑制物對轉化細胞進行加壓篩選已獲得高表達細胞株；對獲得的高表達細胞株進行擴大培養，最后分離提取目的外源基因的表達產物。

8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述的用于多個外源基因表達的步驟為：在外源基因插入位點插入目的外源基因一，然后在所述多克隆位點插入目的外源基因二，或是目的外源基因二和三的表達元件，構建雙標記篩選多基因表達載體；所述的外源基因二或三的表達元件包括控制目的基因轉錄的啟動子、目的基因序列、以及PolyA終止信號；所述表達載體轉入宿主細胞得到轉化細胞；在基礎培養基中添加葉酸類似物甲喋呤和谷氨酰胺合成酶抑制物對轉化細胞進行加壓篩選已獲得高表達細胞株；對獲得的高表達細胞株進行擴大培養，最后分離提取目的外源基因的表達產物。

9.根據權利要求7或8所述的應用，所述宿主細胞為哺乳動物細胞。

10.根據權利要求9所述的應用，所述哺乳動物細胞為非DHFR缺陷型的宿主細胞。

11.根據權利要求10所述的應用，所述哺乳動物細胞為CHO?K1細胞。