[發(fā)明專利]一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210476115.9
• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號: CN102994537A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡友華;鄭明英;嚴杰能;陸最青
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市君盈知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44315
• 代理人: 楊利娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

核苷酸作為重要的食品添加劑和藥物中間體而被業(yè)界廣泛關(guān)注并研發(fā)，其中5`-肌苷酸鈉(5`-IMP)?和5`-鳥苷酸鈉(5`-GMP)具有濃烈的鮮味，是新一代雞精調(diào)味品的主要原料，而3`-肌苷酸鈉和2`-肌苷酸鈉鮮味則基本沒有鮮味(周秀芹，2010)。當(dāng)前，以肌苷和鳥苷為原料加上合適磷酸供體，采用化學(xué)法和酶法催化都可以獲得5`-肌苷酸和5`-鳥苷酸，然而由于酶法具有催化條件溫和、專一性較強、對環(huán)境友好、特異性高等特點(Asano和MIhara等,1999;崔桂友，2003；宋勇波和儲炬等，2003；Kuninaka,?1960?)，而受到國內(nèi)外科研人員和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注，發(fā)展迅速。其中，日本味之素公司已采用酶催化技術(shù)生產(chǎn)呈味核苷酸，韓國希杰則利用發(fā)酵直接產(chǎn)肌苷酸和鳥苷酸。希望能夠充分利用酸性磷酸酶這一催化特性(ZHANG?Chong和XING?Xinhui等，2005)，以期開發(fā)出高效生產(chǎn)呈味核苷酸的酶工程技術(shù)。

酸性磷酸化酶在大腸桿菌表達之后，催化過程會表現(xiàn)出一定程度降解肌苷成次黃嘌呤，影響了肌苷的轉(zhuǎn)化率，對后續(xù)的提取過程中肌苷的套用增加了難度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構(gòu)建方法，用于阻斷肌苷轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤。

嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤補救合成途徑的關(guān)鍵酶之一，廣泛存在于原核和真核生物中(Bzowska和Kulikowska等，2000?)。該是一種戊糖基轉(zhuǎn)移酶，催化嘌呤核苷與正磷酸作用生成自由嘌呤及核糖-5-磷酸的反應(yīng)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構(gòu)建方法，為敲除其嘌呤核苷磷酸化酶基因（purine?nucleoside?phosphorylase，簡稱PNP），本發(fā)明利用Red/ET系統(tǒng)同源重組，在四環(huán)素（Tet）和卡那霉素（Kam）雙重抗性下篩選嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26，沉默肌苷水解為次黃嘌呤的途徑，提高磷酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化率。

一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

（1）通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因，設(shè)計引物PCR擴增得到同源重組缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以驗證宿主中PNP的存在；

所述引物為：PNP-upper:?5’-TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’；

PNP-lower:?5’-CGGATGTGGTCAGATACGGT-3’；

（2）通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因及其上下游基因的同源性情況，根據(jù)K006-Ecoli-Gene?Deletion?Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，擴增得到在Red/ET系統(tǒng)同源重組中的功能片段；

所述功能段擴征的引物為：

deoD-FRT-f：

5'-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG；

deoD-FRT-r：

5'-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC；

（3）制備宿主的感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)質(zhì)粒pRedET，幫助功能片段同源重組：

（4）阿拉伯糖誘導(dǎo)含有pRedET的感受態(tài)宿主后，電轉(zhuǎn)化線性的功能片段；

（5）在pRedET質(zhì)粒的幫助下，功能片段與染色體基因組上的PNP進行同源重組：

（6）電轉(zhuǎn)化表達質(zhì)粒706-FlP，幫助消除同源整合到染色體上的抗性標記：

（7）通過溫度變化，消除抗性標記以及丟失表達質(zhì)粒706-FlP。

在上述構(gòu)建方法中，在該方法中用于重組和缺失抗性標記的兩個質(zhì)粒pRedET和706-FLP均為K006-Ecoli-Gene?Deletion?Kit提供。

在上述構(gòu)建方法中，步驟（3）是采用Eppendorf-Electroporator2510電轉(zhuǎn)儀，在1350V下進行電轉(zhuǎn)。