[發明專利]一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構建方法

無效

• 申請號: 201210476115.9
• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號: CN102994537A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 蔡友華;鄭明英;嚴杰能;陸最青
• 申請（專利權）人: 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市君盈知識產權事務所(普通合伙) 44315
• 代理人: 楊利娟

1.一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因，設計引物PCR擴增得到同源重組缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以驗證宿主中PNP的存在；

所述引物為：PNP-upper:?5’-TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’；

PNP-lower:?5’-CGGATGTGGTCAGATACGGT-3’；

（2）通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因及其上下游基因的同源性情況，根據K006-Ecoli-Gene?Deletion?Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，擴增得到在Red/ET系統同源重組中的功能片段；

所述功能段擴征的引物為：

deoD-FRT-f：

5'-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG；

deoD-FRT-r：

5'-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC；

（3）制備宿主的感受態細胞，電轉質粒pRedET，幫助功能片段同源重組：

（4）阿拉伯糖誘導含有pRedET的感受態宿主后，電轉化線性的功能片段；

（5）在pRedET質粒的幫助下，功能片段與染色體基因組上的PNP進行同源重組：

（6）電轉化表達質粒706-FlP，幫助消除同源整合到染色體上的抗性標記：

（7）通過溫度變化，消除抗性標記以及丟失表達質粒706-FlP。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，在該方法中用于重組和缺失抗性標記的兩個質粒pRedET和706-FLP均為敲除試劑盒提供。

3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（3）是采用Eppendorf-Electroporator2510電轉儀，在1350V下進行電轉。

4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，構建過程所用的培養基均為LB，培養溫度在30-37℃，pH在6.0-7.0。