[發(fā)明專利]禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210475785.9
• 申請(qǐng)日: 2012-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN102936280A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳子健;王亮;呂瑜峰;李建穎;孫佩佩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津商業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/465
• 分類號(hào): C07K14/465;C07K1/18
• 代理公司: 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 肖莉麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法。?

背景技術(shù)

PVS即卵黃高磷蛋白是蛋黃中主要的磷蛋白，約占蛋黃蛋白質(zhì)的7%，有α-PVS（37、42和45Ku）和β-PVS（45Ku）兩種，其中β-PVS含量較α-PVS多，卵黃高磷蛋白具有獨(dú)特的物化特性，其分子中磷的含量約10%，是已知蛋白質(zhì)中磷酸化程度最高的，主要原因在于其分子中約50%的氨基酸殘基是絲氨酸殘基，且90%絲氨酸殘基被磷酸化，正是由于其高度磷酸化性質(zhì)，使其具有很強(qiáng)的乳化性、抗氧化性、殺菌性以及金屬離子螯合力（蛋黃中所含的約95％的鐵離子與其結(jié)合），可應(yīng)用于制藥、食品以及化妝品等諸多領(lǐng)域。?

卵黃高磷蛋白最早是由Mecham和Olcott從雞蛋黃中分離出來。經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，現(xiàn)有的分離方法主要有鹽沉淀法、鹽浸提法、膜分離技術(shù)以及利用具有親和活性的鐵系無機(jī)納米材料來富集卵黃高磷蛋白，其純化方法都是采用色譜技術(shù)。1986年，Wallace和Morgan利用水溶液來提取卵黃高磷蛋白，其后的純化采用疏水作用色譜。盡管獲得了很高的純度，但其分離方法繁瑣，得率僅為0.96%（占蛋黃干重）。1994年，Losso和Nakai在此基礎(chǔ)上建立了一種更為簡便的鹽浸提方法，但其過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，大量使用有機(jī)溶劑（正己烷），影響到最終產(chǎn)品的生物安全性。2003年，Castellani等利用卵黃高磷蛋白可以與鎂離子形成沉淀的特性來提取該蛋白質(zhì)，所得蛋白質(zhì)純度僅為85%，后續(xù)純化采用陰離子高效液相色譜得到高純度的卵黃高磷蛋白，但該技術(shù)不適于擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)。2007年，徐芳等人用具有鐵原子親和活性位點(diǎn)的鐵系無機(jī)納米材料與粗制卵黃脂蛋白相互作用，得到特異性吸附有卵黃高磷蛋白的鐵系納米材料，最后經(jīng)煮沸處理得到卵黃高磷蛋白。與傳統(tǒng)技術(shù)比，該發(fā)明操作過程簡單，但是納米材料價(jià)格昂貴，其最后的純度也僅有80%。?

2010年，日本和加拿大的研究人員嘗試使用膜超濾法來大規(guī)模富集卵黃高?磷蛋白，并同時(shí)達(dá)到脫鹽的目的。盡管該方法簡單易行，但其終產(chǎn)品純度不高，N/P比最高僅為6.64，與sigma標(biāo)準(zhǔn)品的2.49相差甚遠(yuǎn)。2011年，Ko等利用乙醇脫脂，10%的NaCl或(NH₄)SO₄來大規(guī)模提取卵黃高磷蛋白，回收率高達(dá)97%，整個(gè)分離過程可在一天內(nèi)完成。盡管文獻(xiàn)提到其蛋白質(zhì)含量大于85%，但是其檢測方法使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確：文獻(xiàn)中使用的是6.25這樣一個(gè)總氮含量轉(zhuǎn)換系數(shù)，因卵黃高磷蛋白中含有大量的磷，因此，并不能確切的表明其純度。而按照Ko的方法經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)制備的卵黃高磷蛋白，采用比較科學(xué)的N/P的表示方法，其N/P比只有4.44，仍需要進(jìn)一步的純化，不足以應(yīng)用于食品醫(yī)藥等對(duì)純度要求較高的行業(yè)。2012年，加拿大學(xué)者Bo等人直接利用陰離子交換色譜法來純化卵黃高磷蛋白，獲得了很高的純度（N/P比為2.5）但回收率僅為35.4%,另外所使用的昂貴的高效液相色譜儀限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種可直接在食品、醫(yī)藥等純度要求較高的行業(yè)應(yīng)用，所得產(chǎn)品純度高，操作簡單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法。?

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是：?

一種禽蛋中卵黃高磷蛋白的提取及純化方法，其特征在于，包括如下步驟：?

（1）取禽蛋中的卵黃去除水溶性物質(zhì)，采用乙醇脫脂后，用高濃度鹽溶液浸提得到卵黃高磷蛋白粗品；?

（2）利用陰離子交換層析法純化上述卵黃高磷蛋白粗品并除鹽，得到高純度的卵黃高磷蛋白。?

所述卵黃去除水溶性物質(zhì)的過程為：取禽蛋中的卵黃加入1-3倍體積（w/v）、溫度為1-10℃的去離子水，在1-10℃低速攪拌0.5-2h；然后在1-10℃、4000-6000×g離心10-30min，棄掉含有水溶性物質(zhì)的上清液，取沉淀得到粗制卵黃脂蛋白。?

所述乙醇脫脂的過程為：向粗制卵黃脂蛋白中加入3-6倍體積（w/v）的乙醇，3000-6000rpm均質(zhì)1-5min，然后在1-10℃、4000-6000×g離心10-30min，取沉淀，重復(fù)上述脫脂過程1-3次，得到脫脂后的卵黃脂蛋白；所述乙醇濃度為60-90%。?