[發(fā)明專利]兩步酶促法制備結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210473483.8
• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN102994604A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王伯初;譚君;婁德帥;祝連彩;劉紹勇;岑小惜;季慶治
• 申請（專利權(quán)）人: 上海凱寶藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P33/00
• 分類號(hào): C12P33/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種7α-羥基類固醇脫氫酶（7α-HSDH）和7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-HSDH）聯(lián)用，兩步法催化結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸的方法。

背景技術(shù)

熊膽是名貴的中藥材，用于治療膽結(jié)石疾病以及各種急性、慢性肝病，具有良好的治療效果。牛磺熊去氧膽酸（TUDCA）是中藥材熊膽的主要有效成份之一。然而，中藥熊膽粉主要的獲取方式為“活熊引流取膽”，這有違野生動(dòng)物保護(hù)法，并且被認(rèn)為是非常不“人道”的獲取方式。不過禽畜膽汁中存在眾多膽酸類物質(zhì)，尤其是雞鴨鵝膽汁中含有豐富的牛磺鵝去氧膽酸（TCDCA）。TCDCA與TUDCA的差別不僅在于7位羥基的差向異構(gòu)，而且它們的生物活性也相差甚遠(yuǎn)。目前TUDCA除可以從熊膽中提取外，其制備的方法還有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。

化學(xué)合成牛磺熊去氧膽酸，國內(nèi)外報(bào)道主要有三種化學(xué)半合成法：①用熊去氧膽酸（UDCA）與氯甲酸乙酯或特戊酰氯反應(yīng)形成混合酸酐，在堿性條件下與牛磺酸反應(yīng)，再經(jīng)離子交換柱純化制得TUDCA，總收率約62%[Arosio?R,Rossetti?V.US?5565587.1995-10-15.(CA1994,122:265776);Dayal?B,et?al.Bioorg?Med?Chem,1996,4]；②UDCA和牛磺酸在堿性條件下分別在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉（EEDQ,N-ethoxy-carbonyl-ethoxy-1,2-dihydroquinoline）或氰基磷酸二乙酯（DEPC，diethyl?phosphorocyanidate）作用下直接縮合得TUDCA，收率分別為67%和90%，此法試劑價(jià)格昂貴[Momose?T,et?al.Lipids,1997,32]；③UDCA和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后，與對羥基苯丙酮縮合，得熊去氧膽酸的活性酚酯，再與牛磺酸反應(yīng)制得TUDCA，總收率約64%，此法反應(yīng)步驟較多[Bonaldi?A?and?Molinari?E.US,5362891.1994-11]。比較三種合成方法，后兩種需用有機(jī)試劑EEDQ和DEPC，價(jià)格昂貴，制備也較煩瑣。

上述合成中的原料UDCA，也主要是通過化學(xué)合成的方法得到。比如，工業(yè)上生產(chǎn)UDCA的7步合成法，以牛、羊膽酸（CA）為原料，經(jīng)膽酸甲酯化，二乙酰化，12位羥基CrO₃-HOAc氧化，黃鳴龍還原合成鵝去氧膽酸（CDCA），再將CDCA氧化成7-羰基石膽酸（7-KLCA），然后在正丙醇中用金屬鈉還原得UDCA。另外，以鵝去氧膽酸（CDCA）為原料，CDCA甲酯化，3位羥基選擇性保護(hù)后用Jones試劑或NBS氧化7位羥基，然后在叔丁醇中用金屬鈉、二氯化鎳還原得UDCA[莊治平,等.有機(jī)化學(xué),1986,(4):281]。

上述描述的化學(xué)合成法制備牛磺熊去氧膽酸的過程復(fù)雜，要使用大量有機(jī)溶劑，存在有機(jī)溶劑殘留等缺點(diǎn)。這些化學(xué)合成法的最大缺點(diǎn)是只能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，且所用的底物是單體純物質(zhì)，無法對混合狀態(tài)存在的膽汁酸（如禽畜膽汁中的TCDCA或CDCA）進(jìn)行原位轉(zhuǎn)化而不影響其他成分。

生物轉(zhuǎn)化也分微生物轉(zhuǎn)化和酶催化法。熊安明和法幼華采用泡木賊鐮刀菌將石膽酸轉(zhuǎn)化為UDCA[熊安明和法幼華.微生物學(xué)報(bào),1995,35:204-208]。劉光澤等利用不和諧梭菌（C.absonum）將水解雞膽汁（不含結(jié)合態(tài)膽汁酸TCDCA）中的CDCA轉(zhuǎn)化成為UDCA[劉光澤等,中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1998,18:74-76]，但微生物本身的代謝會(huì)產(chǎn)生多種物質(zhì)，也給水解雞膽汁引入了很多雜質(zhì)，使產(chǎn)物的純化更加困難，且操作復(fù)雜，效率較低。