[發(fā)明專利]兩步酶促法制備結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210473483.8
• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號: CN102994604A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王伯初;譚君;婁德帥;祝連彩;劉紹勇;岑小惜;季慶治
• 申請（專利權(quán)）人: 上海凱寶藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

1.兩步酶促法制備結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸的方法，包括如下步驟：（1）在7α-羥基類固醇脫氫酶和氧化型輔酶NAD⁺或NADP⁺存在的條件下將溶于水溶液中的底物結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸的7位α-羥基氧化成羰基，形成中間產(chǎn)物結(jié)合態(tài)7-羰基-石膽酸；（2）在步驟（1）反應(yīng)后的混合物中，向混合物中加入7β-羥基類固醇脫氫酶和還原型輔酶NADH或NADPH，將中間產(chǎn)物7位羰基還原成β-羥基得到結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的水溶液的pH值為7-9。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的水溶液為pH8.5磷酸鹽緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟（1）、（2）的反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為1-3小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸包括牛磺鵝去氧膽酸見式（1）、甘氨鵝去氧膽酸見式（2）；結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸包括牛磺熊去氧膽酸見式（3）、甘氨熊去氧膽酸見式（4）。

。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的7α-HSDH和7β-HSDH轉(zhuǎn)化的底物是以單體形式存在或者以天然混合物狀態(tài)存在。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的天然混合物狀態(tài)包括禽畜膽汁。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，禽畜膽汁包括雞、鴨、鵝、牛、狗、兔、羊的膽汁。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的7α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥基類固醇脫氫酶來自于微生物。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述7α-羥基類固醇脫氫酶來自撒丁島梭菌（Clostridium?sardiniense，ATCC27555）和脆弱擬桿菌（Bacteroides?fragilis?ATCC25825）；所述7β-羥基類固醇脫氫酶來自撒丁島梭菌（Clostridium?sardiniense，ATCC27555）和產(chǎn)氣柯林斯菌(Collinsella?aerofaciens，ATCC25986)。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的7α-HSDH和7β-HSDH是在非致病微生物中的表達(dá)產(chǎn)物。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述非致病微生物為大腸桿菌。?