[發明專利]糖類抗原50磁微粒化學發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201210472473.2
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN103018445A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 劉萍;范利花
• 申請（專利權）人: 博奧賽斯（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/531
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 李莉華

技術領域

本發明涉及免疫分析醫學領域，具體的，本發明提供了一種糖類抗原50（CA50）磁微粒化學發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

癌癥亦稱惡性腫瘤，是嚴重威脅人類健康的一種疾病，據統計，我國每年新患癌癥的病人約160萬人，每年因癌癥死亡的人數約130萬人，按目前的醫療水平，早期癌癥病人約有80%～90%可以治愈，大大降低了癌癥病人的死亡率，可見癌癥病人的早期發現、早期診斷和早期治療尤為重要。

糖類抗原50（CA50）是一種非特異性的廣譜腫瘤標志物，以唾液蛋白和唾液酸糖脂為主要成分的一種神經節苷脂抗原，1983年Lindholm等應用結腸癌細胞為免疫原首次制備出CA50單克隆抗體。CA50以脂或脂蛋白結合的形式存在于細胞膜，在正常組織中一般不存在，當細胞惡變時，糖基化酶被激活，造成細胞表面糖基結構改變而成為CA50標志物。CA50對多種上皮類惡性腫瘤有較高的陽性檢出率，一般在消化道腫瘤的病人中可以觀察到血清中CA50含量升高，與CEA、CA125、CA199等標志物聯檢，可為疾病的前期篩查、輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、癌細胞轉移以及預后提供有參考價值的依據。

在臨床上，正常人的血中CA50含量＜20μg/L，許多惡性腫瘤患者血中皆可升高，如66.6％的肺癌、88.2％的肝癌、68.9％的胃癌、88.5％的卵巢或子宮頸癌、94.4％胰或膽管癌，其他如直腸癌、膀臟癌等皆有70％以上是升高的，另外，潰瘍性結腸炎、肝硬化、黑色素瘤、淋巴瘤，自身免疫性疾病等也有CA50升高現象。

目前常用的檢測CA50的方法有放射免疫分析技術（RIA）和酶聯免疫分析法（ELISA），但是這兩種方法存在諸多不足，例如RIA存在放射性污染、標記物半衰期短、對操作者具有放射性損傷，且操作繁瑣，時間長等缺點；而ELISA靈敏度低，檢測范圍窄；隨著標記免疫技術的迅速發展，各種新的檢測方法層出不窮，其中化學發光免疫分析（CLIA）是將化學發光和酶免疫分析結合在此技術上發展起來的，是當今最為敏感的微量免疫測定法。

發明內容

本發明要解決的問題是提供CA50的化學發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法，避免了放射性免疫分析的試劑有效期短、存在放射性污染、操作繁瑣等缺點，且解決了靈敏度低，檢測范圍窄，成本高的缺陷。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：糖類抗原50磁微粒化學發光免疫定量檢測試劑盒，包括：糖類抗原50校準品，濃度為0、5、10、25、50、100KU/mL，校準品稀釋液為50%牛血清；偶聯有鏈霉親和素的磁微粒懸浮液；生物素標記的糖類抗原50抗體；糖類抗原50抗體酶結合物，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；糖類抗原50質控品；化學發光液A液和B液；20倍濃縮洗液；反應管。

進一步，所述的發光液A液的主要成分為魯米諾，B液的主要成分是過氧化脲。A液為0.7g/L魯米諾，0.165g/L對碘酚，緩沖液為pH8.6的5mmol/L?Tris·HCl，避光保存；B液為0.675g/L過氧化脲，用工藝用水配制。

進一步，所述的磁微粒是表面包裹帶有氨基或羧基活性基團的四氧化三鐵，粒徑1～2um。

進一步，所述的糖類抗原50質控品包括低值質控品和高值質控品。

進一步，所述的反應管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

（1）糖類抗原50校準品的配制：

將CA50純品用50%牛血清溶液稀釋成系列梯度，濃度分別為0、5、10、25、50、100KU/mL。

（2）糖類抗原50質控品的配制：

將糖類抗原50用含有50%牛血清溶液稀釋配制低值質控品高值質控品，低值質控品（QcL）和高質質控品（QcH）的允許范圍分別為8～12KU/mL和29.6～44.4KU/mL。

（3）磁性顆粒-鏈霉親和素懸浮液的制備：

取100mL0.1mol/L?2-嗎啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性顆粒和3mg鏈酶親和素（SA），攪拌30min，然后加入10mg/mL碳二亞胺鹽酸鹽溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反應1h后，使用磁力架吸附，靜止10min，移去液體，加入10mL?0.01mol/L?PBS，重復上述過程，共洗滌3次，最后用0.01mol/L?PBS定溶至1L即可。

（4）生物素標記的CA50抗體的制備