[發(fā)明專利]檢測腫瘤標(biāo)志物流動注射化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210472350.9
• 申請日: 2012-11-21
• 公開（公告）號: CN102967706A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 顏梅;楚成超;葛慎光;葛磊;張彥;王盼盼;李偉平;李龍;李蒙;劉芳;劉偉艷;王衍虎;于京華
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N21/76;G01N33/531
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫標(biāo)記物檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是一種流動注射化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備本發(fā)明還涉及采用所述的流動注射化學(xué)發(fā)光傳感器測免疫標(biāo)記物的方法。?

背景技術(shù)

近年來，免疫分析是臨床檢驗中一項重要的腫瘤疾病的診治手段。一直以來，惡性腫瘤也就是癌癥都是人類健康和生命安全的一個嚴(yán)重威脅。癌癥細胞，是指一些擁有分裂潛能的細胞在致癌因素的作用下發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化和克隆性增生而產(chǎn)生的一種新生物。并且癌細胞除了自身的生長失控外，還會侵入周遭正常組織甚至可以經(jīng)由體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)或者淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體的其他部分，從而引起身體病變甚至死亡。所以，癌癥早期的診斷和及早的治療具有重要的意義。但是癌癥早期的抗原含量較低很難被發(fā)現(xiàn)，低含量的抗原的測定成為了分析人員的重要追求。?

免疫分析法是利用抗體與抗原特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的高選擇性生物化學(xué)方法。近年來，隨著現(xiàn)代生物傳感器技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫分析在食品安全、臨床診斷、微生物檢驗、藥物分析與環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。免疫分析包括非標(biāo)記性免疫分析和標(biāo)記性免疫分析。非標(biāo)記免疫包括免疫擴散和免疫電泳，是可溶性的抗原和相對應(yīng)的抗體在溶液或凝膠中進行接觸，從而形成一種不溶性抗原-抗體復(fù)合物進行分離的技術(shù)。標(biāo)記性免疫分析技術(shù)是采用光電物質(zhì)、同位素或酶等示蹤物質(zhì)來標(biāo)記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應(yīng)，通過對免疫復(fù)合物中的標(biāo)記物信號的測定，從而達到對免疫反應(yīng)進行監(jiān)測的目的。標(biāo)記性免疫分析技術(shù)放射免疫分析、酶聯(lián)免疫吸收分析、毛細管電泳化學(xué)發(fā)光免疫分析、高效液相色譜化學(xué)發(fā)光免疫分析、微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)免疫分析、電致發(fā)光免疫分析、熒光免疫技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和鐵蛋白免疫技術(shù)等。但是這些免疫分析方法一般耗時較長并且擁有繁瑣的加樣、溫育、洗滌等操作過程，而且操作人員和免疫物質(zhì)的接觸較多，可能對操作的人員的身體健康造成危害。而且有些測定速度快、靈敏度高、檢測性低的檢測手段需要儀器昂貴，不能在發(fā)展中國家普及。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種靈敏度高、檢測速度快、試劑用量少，檢測腫瘤標(biāo)志物的流動注射化學(xué)發(fā)光傳感器。?

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的：一種檢測檢測腫瘤標(biāo)志物的流動注射化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，其包括以下步驟：?

（1）利用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制備流動注射化學(xué)發(fā)光流通池；

（2）按照現(xiàn)有方法制備出碳量子點，碳包覆的四氧化三鐵，二氧化硅和空殼金納米粒子；

（3）將發(fā)光碳量子點修飾在碳包覆的四氧化三鐵上，然后將一抗修飾在表面；

（4）將空殼金納米粒子修飾在二氧化硅粒子上，然后將二抗和葡萄糖氧花酶修飾在空殼金粒子上；

（5）將制作好的化學(xué)發(fā)光傳感器結(jié)合流動注射化學(xué)發(fā)光儀對免疫標(biāo)記物進行檢測。

本發(fā)明所述發(fā)光碳量子點修飾碳包覆四氧化三鐵及空殼金包覆二氧化硅的制備包括以下步驟：?

（1）碳包覆四氧化三鐵的制備：將四氧化三鐵浸入到硝酸溶液中超聲10?min，后通過磁鐵的作用進行分離，二次水沖洗，然后在5%的葡萄糖溶液中超聲10?min，二次水沖洗，最后四氧化三鐵的水溶液在高壓釜中以180?℃中反應(yīng)10?h；

（2）碳量子點的制備：在pH?7.0的磷酸緩沖溶液（PBS）中，以石墨電極為工作電極，銀/氯化銀電極為參考電極，鉑電極為對電極，在-3.0?V~3.0?V電壓范圍以0.1?V/s的掃速反應(yīng)24?h，離心分離，二次水沖洗；

（3）將（1）制備的碳包覆四氧化三鐵浸入到0.20%鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）中攪拌20?min使其表面帶上正電，然后通過磁鐵的作用進行分離，二次水沖洗；

（4）將（3）得到的碳包覆四氧化三鐵浸入到（2）得到的碳量子點溶液中并攪拌20?min形成一碳量子點層；

（5）重復(fù)以上（3）（4）過程可以得到需要的量子點層數(shù)；

（6）（5）中制得碳量子點包覆磁性粒子浸入到1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺（EDC）溶液中20?min，然后通過磁鐵的作用進行分離，PBS沖洗后將一抗加入，反應(yīng)20?min，最后加入牛血清白蛋白（BSA）封閉活性位點，制備好的溶液保存在4?℃的冰箱中待用；