[發(fā)明專利]對多個混合DNA或RNA序列進(jìn)行基因測序的方法及裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210472293.4
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN103045726A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李周芳;賀建奎;施國寧
• 申請（專利權(quán)）人: 南方科技大學(xué);深圳市瀚海基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/34
• 代理公司: 深圳市威世博知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44280
• 代理人: 何青瓦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種對多個混合的DNA或RNA序列進(jìn)行基因測序的方法以及裝置。

背景技術(shù)

在免疫細(xì)胞群中，T淋巴細(xì)胞受體分子（TCR，T?cell?receptor）和B淋巴細(xì)胞受體分子（BCR，B?cell?receptor）的多樣性是以十萬到百萬計(jì)。組成TCR或BCR的α和β鏈，不僅各自結(jié)構(gòu)不同，各鏈的形成還經(jīng)歷了V、J或V、J、D不同區(qū)域中眾多基因片段的組合。

在研究TCR和BCR的多樣性時，需要對TCR和BCR的V、J或V、J、D不同區(qū)域中眾多基因片段進(jìn)行測序。一般來說，現(xiàn)有的測序技術(shù)可以適應(yīng)一般的基因測序的要求。但是，對于研究TCR和BCR的多樣性來說，現(xiàn)有的測序技術(shù)的錯誤率太高，以至于無法根據(jù)得到的測序結(jié)果，辨別出來的眾多基因片段之間的細(xì)微區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種對多個混合DNA或者RNA序列進(jìn)行基因測序的方法以及裝置，能夠利用現(xiàn)有的測序技術(shù)提高基因測序的準(zhǔn)確性，顯著減少基因測序的錯誤率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明針對不同的起始模板，分別采用了兩種技術(shù)方案，對于以多個混合的DNA序列為模板進(jìn)行基因測序的，采用的一個技術(shù)方案是：包括：將M對第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體TCR和/或B淋巴細(xì)胞受體BCR的N個DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一PCR產(chǎn)物，其中，所述M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，所述第一上游引物序列或第一下游引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及第一上游基礎(chǔ)引物序列或第一下游基礎(chǔ)引物序列，每對第一上游引物序列與第一下游引物序列的標(biāo)簽序列使得每個DNA序列經(jīng)過PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，所述接頭序列是使每個DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列，所述第一上游基礎(chǔ)引物序列與第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與所述DNA序列兩條單鏈的3’末端互補(bǔ)；對所述第一PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第一DNA產(chǎn)物，所述第一DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含所述第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含所述第一上游引物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列；將所述獲得的第一DNA產(chǎn)物與第二上游引物序列和第二下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二PCR產(chǎn)物，其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的接頭序列；對所述第二PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第二DNA產(chǎn)物；對所述第二DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，并分析測序結(jié)果，獲得每個DNA序列的測序結(jié)果。

其中，所述接頭序列包括測序引物序列、測序公司標(biāo)識序列以及測序公司接頭序列，所述測序引物序列、測序公司標(biāo)識序列以及測序公司接頭序列順序連接，所述測序引物序列連接所述第一上游引物序列或第一下游引物序列的標(biāo)簽序列，所述測序公司標(biāo)識序列用于區(qū)別來自不同樣本的多個DNA序列。

其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的測序公司接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的測序公司接頭序列。

其中，所述標(biāo)簽序列的堿基個數(shù)是八個，或者七個，或者六個。

其中，所述對第二DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，并分析測序結(jié)果，獲得每個DNA序列的測序結(jié)果的步驟，包括：對所述第二DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，獲得DNA測序結(jié)果；將所述DNA測序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個DNA序列的所有的DNA測序結(jié)果；比較所述屬于同一個DNA序列的所有的DNA測序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所述所有的DNA測序結(jié)果中每個位置出現(xiàn)相同堿基的頻次；判斷所述每個位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值；若達(dá)到預(yù)定的閾值，則確定所述屬于同一個DNA序列的所述位置的堿基，按照所述方法，即可確定所述屬于同一個DNA序列的所有位置的堿基。