[發明專利]一種定量檢測TRECs和KRECs基因的實時熒光定量PCR試劑盒以及應用

有效

• 申請號: 201210470713.5
• 申請日: 2012-11-20
• 公開（公告）號: CN103173533A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 王曉川;劉丹如;王牧;房聰
• 申請（專利權）人: 無錫聯合利康臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京泛誠知識產權代理有限公司 11298
• 代理人: 陳波;文琦

技術領域

本發明屬于體外核酸診斷領域，涉及一種定量檢測游離T細胞受體切除環（T-cell?receptor?excision?circles，TRECs）和κ-刪除重組切除環（κ-deleting?recombination?excision?circles，KRECs）基因的實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）試劑盒及其應用。

背景技術

原發性免疫缺陷病（Primary?Immunodeficiency?Disease，PID）是因免疫系統遺傳缺陷或先天發育不全造成免疫功能障礙所致的免疫缺陷病，其總發病率為：美國1/10000，澳大利亞2.82/100000人，日本和瑞典1/5000人，我國香港地區1/8000人。國內缺乏全面的統計資料，如果按照1/10000的發病率，我國每年出生的2500萬個新生兒中有2500個新發的PID病例，整個兒童期累計患者達到3萬-6萬例。原發性免疫缺陷病，與遺傳相關，常發生在嬰幼兒，可出現反復感染，嚴重的可威脅生命。因其中有些可能獲得有效的治療，因此及時診斷仍很重要。

2001年11月，美國疾病控制和預防中心（Centers?for?DiseaseControl?and?Prevention,CDC）在喬治亞洲首府亞特蘭大召開專題研討會，建立針對新生兒篩查（Newborn?Screening,NBS）實驗和早期識別PID的方案，以便能早期診斷和治療PID患者。2009年美國CDC在美國維斯康星州進行重癥聯合免疫缺陷（Severe?CombinedImmunodefieieney?Disease，SCID）新生兒篩查。

按免疫缺陷性質的不同，原發性免疫缺陷病可分為體液免疫缺陷為主（即抗體缺乏為主的免疫缺陷）、細胞免疫缺陷為主以及兩者兼有的聯合性免疫缺陷三大類。此外，補體缺陷、吞噬細胞缺陷等非特異性免疫缺陷也屬于本組。重癥聯合免疫缺陷病是以T淋巴細胞缺乏或功能異常，伴或不伴有B淋巴細胞和NK細胞數量減少或功能缺陷為特征的一組疾病，新生兒發病率大約在1/50000至1/100000，該病發病年齡早，臨床表現重，預后較差，如果沒有得到及時的診斷和治療，多在2歲內死亡。SCID是一種嚴重的聯合免疫缺陷，患兒如果不進行有效的免疫重建，往往在嬰兒期死亡，免疫重建的時間與預后的關系密切，如果在出生3個月內進行造血干細胞移植存活率接近95%，而3個月后進行造血干細胞移植存活率降至76%，因此將SCID納入新生兒篩查非常必要。

目前SCID主要分為T-B+SCID和T-B-SCID兩大類，其中T-B+SCID的致病原因有γc基因缺陷、Janus?Kinase?3（JAK3）基因缺陷、IL-7Rα基因缺陷、CD45基因缺陷、CD3δ/CD3ε/CD3ζ基因缺陷；T-B-SCID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、DCLRE1C基因缺陷、ADA基因缺陷、DNA?PKcs基因缺陷、網狀組織發育不全。除此以外，SCID還包括Oemnn綜合征、DNA連接酶Ⅵ、Cemunnos/XLF缺陷、CD40配體缺陷、CD40缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）缺陷、CD3γ缺陷、CD8缺陷、ZAP-70缺陷、MHC?Ⅰ類分子缺陷、MHC?Ⅱ類分子缺陷、鈣離子通道缺陷等。導致SCID的原因繁多，診斷非常困難，但是所有SCID的共同特征是成熟T細胞的數量顯著降低。

T細胞在胸腺中分化的過程是發生在T細胞受體基因的重排的時候，最終是V、D和J基因片段的結合；在每個V、D和J基因片段重排的過程中，都會有被切除的環狀DNA產物，被切割下來的DNA形成游離T細胞受體切除環（T-cell?receptor?excision?circles，TRECs），70%表達αβTCRs的T細胞在成熟晚期都產生TREC。TRECs在T細胞中非常穩定，并不隨著細胞的增殖而增加，而是不斷被稀釋，新生兒TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明顯降低。利用定量PCR檢測δRec-ψJα?TRECs可以反映外周血最新產生的T淋巴細胞數量，病人T細胞中TRECs缺乏或不同程度的減少，可以作為SCID的篩查方法，篩查出T細胞成熟缺陷的新生兒，有利于早診斷早治療，減少新生兒死亡。