[發明專利]植物根部特異表達Bt-cry6A晶體蛋白在根結線蟲防治中的應用

有效

• 申請號: 201210470439.1
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN103045637A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 陳國華;梅眉;王殿東;田雪亮;茆振川;楊宇紅;謝丙炎
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00;A01H4/00;C12R1/01
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

1.用于在植物根部特異表達Bt-cry6A基因的重組表達載體pBP-bt06，骨架載體為pBI121，啟動子為DNAβpromotor，外源基因為序列為SEQ?ID?No.4所示的優化Bt-cry6A基因。

2.轉入有權利要求1所述重組表達載體的菌株。

3.根據權利要求1所述的菌株，指轉入有pBP-bt06的根癌農桿菌（Agrobacterium?tumefaciens）EHA?105。

4.一種研究蘇云芽孢桿菌基因功能的新方法,其特征在于，將權利要求1所述的重組表達載體轉化到根癌農桿菌中，然后轉化植物，通過觀察轉基因植株，確定此基因對根結線蟲的防治效果。

5.一種獲得抗根結線蟲的轉基因植物的方法，包括如下步驟：

（1）構建含有蘇云金芽孢桿菌的Bt-cry6A基因的根部特異性重組表達載體，

（2）將重組表達載體轉入到宿主植物中，篩選能夠表達Bt-cry6A蛋白的陽性轉化子，

所述重組載體是pBP-bt06。

6.根據權利要求5所述的方法，所述將重組表達載體轉入到番茄中，篩選能夠表達Bt-06蛋白的陽性轉化子，包括如下步驟：

（1）準備植物轉化外植體，

（2）制備農桿菌轉化液，所述農桿菌指轉入有pBP-bt06的根癌農桿菌（Agrobacterium?tumefaciens）EHA105，

（3）農桿菌轉化液侵染外植體，然后共培養，

（4）對共培養的外植體進行選擇培養以分化愈傷組織，

（5）生根培養分化的愈傷組織獲得轉基因植株。

7.根據權利要求6所述的方法，

所述準備植物轉化外植體包括外植體預培養，指將取自番茄幼苗的外植體放置在MS+50μg/μl乙酰丁香酮的固體培養基上，光照預培養2天，

所述共培養指采用MS+100μg/μl乙酰丁香酮的固體培養基，避光培養2天，

所述選擇培養指采用MS+2mg/L?6BA+0.2mg/L?IAA+300mg/L羧芐青霉素+50μg/ml卡那霉素+10μg/ml玉米素的培養基，26-28℃，光照培養16h，

所述生根培養指長到2～3厘米的分化良好的愈傷組織轉移到生根培養基MS+0.25mg/LIAA+25μg/ml卡那霉素+200μg/ml頭孢霉素上。

8.根據權利要求5～7任一所述的方法，所述制備農桿菌轉化液指采用1/2濃度的液體MS＋200μg/μl乙酰丁香酮為懸浮劑懸浮菌體。