[發明專利]C反應蛋白標準物質定值的方法

無效

• 申請號: 201210468473.5
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102998361A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 宋德偉;李紅梅;徐蓓
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 王菲

技術領域

本發明涉及一種標準物質的定值方法，尤其是涉及一種C反應蛋白標準物質定值的方法。

背景技術

對通過均勻性、穩定性檢驗合格樣料的特性值進行測量，在標準物質技術領域稱為表征化(原文為characterize，即對材料特性進行測量)；由計量權威部門對表征化獲得的樣料特性的量值進行計量學溯源性(以下簡稱溯源性)確認和相應測量不確定度評定合理性確認，在標準物質技術領域稱為定值(原文為certify，即對測量獲得的結果進行認證確認，在其它技術領域一般稱為認證)。因此，對有證標準物質的定值，實際上應分為兩步：首先是對經過均勻性、穩定性檢驗合格的樣料特性值進行測量，也就是表征化；然后是對測量結果的溯源性和測量不確定度評定的合理性進行有效性確認。

C反應蛋白（C-reactionprotein，CRP）在1930年由Tillet和Francis發現。最初他們觀察到一些急性病人的血清可與肺炎鏈球菌的莢膜C-多糖發生反應，隨后證實能與C-多糖反應的物質是一種蛋白質，因而將這種蛋白質命名為C反應蛋白（C-reaction?protein，CRP）。CRP是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時肝細胞合成的急性相蛋白。CRP的測定，可用來對下列情況治療監測：

（1）在許多急性感染時，作為最有效使用抗生素治療的依據。

（2）在高危病人缺少微生物學診斷時，進行抗生素治療。

（3）在CRP下降至正常時，中斷抗生素治療。

（4）根據CRP的水平變化來決定抗炎藥物的劑量。

（5）在有些難以進行臨床評估的風濕性疾病中，快速選擇合適的抗治療。

（6）估計并發癥的開始。如在風濕性多肌痛患者中巨細胞動脈炎的發展。

在實際檢測工作中，主要是采用C反應蛋白分析儀對C反應蛋白進行測定，其均需要使用C反應蛋白標準物質，但是對于其標準物質定值是否準確的研究現在還很少。

發明內容

本發明所解決的技術問題是填補上述技術空白，提供一種C反應蛋白標準物質定值的方法，具有良好的準確性、可靠性和溯源性。

上述定值方法，包括以下步驟：

(1)合成三條特異性肽段：ESDTSYVSLK、APLTKPLK、ALKYEVQGEVFTK用于進行C反應蛋白定量；

(2)同時使用全氘標記的亮氨基合成對應的三條同位素標記肽段；

(3)以亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸標準物質為標準，以同位素標記亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸為內標，采用同位素稀釋質譜法對合成的三條標準肽段進行準確定量；

(4)按400μL溶液中所含C反應蛋白質量，根據三條肽段的純度計算酶切后所得三條目標肽段的質量，配制相應濃度標準肽段及同位素內標肽段；

(5)準確稱量400μL?C反應蛋白溶液，加入并稱量相應體積的同位素內標溶液；使酶切后所得目標肽段與內標肽段摩爾比為1:1；

(6)離心干燥上述已加入內標的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液對蛋白進行變性處理；10min后加入2μL?1M的二硫蘇糖醇溶液在60攝氏度水浴中加熱60min；然后加入2μL?1M的碘乙酰胺，在暗處反應40min；加入6μL?1M的二硫蘇糖醇還原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氫胺溶液稀釋尿素至1M以下，加入2μL?0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液進行酶切，每24小時補充2μL的胰蛋白酶；酶切96小時后采用同位素稀釋質譜法對三條肽段進行準確定量；

(7)根據質譜所得酶切后肽段與同位素肽段的比例配制標準肽段與內標肽段比例的標準曲線；計算溶液中肽段含量，根據蛋白的分子量計算每400μL溶液中C反應蛋白的濃度作為標準物質的定值結果。

其中本發明中使用的C反應標準物質制備過程：

(1)配制濃度為20mmol/L的Tris-HCl（pH7.5）,0.35moL/NaCl,2mmol/L?CaCl₂溶液，0.5%NaN₃用于溶解經過純化的CRP。

(2)配制濃度為50μg／g?CRP溶液。

(3)將CRP溶液分裝至500μL凍存管中，每只凍存管中分裝400μL溶液，分裝好的標準物質在－80攝氏度冰箱中冷凍保存。

采用上述技術方案，本發明可以達到的技術效果是：

(1)采用Tris-HCl,NaCl,CaCl₂，NaN₃溶解制備CRP標準物質，提高了CRP溶解度，保證了標準物質的均勻性；