[發明專利]C反應蛋白標準物質定值的方法

無效

• 申請號: 201210468473.5
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102998361A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 宋德偉;李紅梅;徐蓓
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 王菲

1.一種C反應蛋白標準物質定值的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)合成三條特異性肽段：ESDTSYVSLK、APLTKPLK、ALKYEVQGEVFTK用于進行C反應蛋白定量；

(2)同時使用全氘標記的亮氨基合成對應的三條同位素標記肽段；

(3)以亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸標準物質為標準，以同位素標記亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸為內標，采用同位素稀釋質譜法對合成的三條標準肽段進行準確定量；

(4)按400μL溶液中所含C反應蛋白質量，根據三條肽段的純度計算酶切后所得三條目標肽段的質量，配制相應濃度標準肽段及同位素內標肽段；

(5)準確稱量400μL?C反應蛋白溶液，加入并稱量相應體積的同位素內標溶液；使酶切后所得目標肽段與內標肽段摩爾比為1:1；

(6)離心干燥上述已加入內標的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液對蛋白進行變性處理；10min后加入2μL?1M的二硫蘇糖醇溶液在60攝氏度水浴中加熱60min；然后加入2μL?1M的碘乙酰胺，在暗處反應40min；加入6μL?1M的二硫蘇糖醇還原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氫胺溶液稀釋尿素至1M以下，加入2μL?0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液進行酶切，每24小時補充2μL的胰蛋白酶；酶切96小時后采用同位素稀釋質譜法對三條肽段進行準確定量；

(7)根據質譜所得酶切后肽段與同位素肽段的比例配制標準肽段與內標肽段比例的標準曲線；計算溶液中肽段含量，根據蛋白的分子量計算每400μL溶液中C反應蛋白的濃度作為標準物質的定值結果。