[發明專利]高效RNA干擾聯合Bt基因雙重防治番茄根結線蟲的方法

有效

• 申請號: 201210468420.3
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN103088053A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 陳國華;王殿東;田雪亮;王運生;茆振川;楊宇紅;謝丙炎
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/32;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明屬于植物病蟲防治技術領域，高效RNA干涉基因和殺線蟲Bt基因聚合轉化番茄，雙重效果共同防治根結線蟲。

背景技術

根結線蟲病嚴重危害我國蔬菜、棉花、花生、煙草等多種經濟作物和水稻、玉米等糧食作物的重要生物災害，近年來農業種植結構與布局調整后問題進一步突出。目前對于作物線蟲病害的防治主要依賴于殺線蟲劑，由于殺線蟲劑防治效果差導致農業減產，加之不合理使用帶來了產品污染和生態環境破壞。因此，作物線蟲病害的嚴重危害，直接威脅著我國的糧食安全和農產品安全。

利用植物介導的RNAi沉默線蟲的關鍵基因成為潛在的最有價值的防治策略，可實現對植物線蟲RNAi介導的分子調控（Urwin?et?al.,2002;Atkinson?et?al.,2003;Victoria?et?al.,2008）。根結線蟲和胞囊線蟲的生長和繁殖所需的營養物質是通過寄生在植物根部提供，利用植物表達線蟲特異基因的dsRNA可實現對植物線蟲的RNAi介導的分子調控。

從微生物資源中挖掘抗線蟲基因是另一個重要的途徑。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis)產生的內毒素是一種對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、線蟲等無脊椎動物具有活性的殺蟲晶體蛋白(Crystal?protein)，對人、畜和一些有益昆蟲不產生毒害作用，且不會造成環境污染。目前全世界共獲得了70種轉Bt基因的植物，種植面積達到26億公頃（James,2005）。雖然在80年代初就有公司對Bt對線蟲具有毒殺作用進行了專利保護。但是，人們對Bt殺線蟲基因的研究卻較少。2000年，加州大學Marroquin等(Marroquin?et?al.,2000)證實Bt殺蟲晶體蛋白對線蟲具有毒殺作用，具有殺線劑的潛力。將晶體蛋白喂食模式線蟲發現線蟲出現不育，死亡等癥狀。2003年，加州大學的Wei等（Wei?et?al.,2003）研究表明，Cry5Aa、Cry5B、Cry6B、Cry12A、Cry13A、and?Cry14A、Cry21A蛋白對模式線蟲均有毒殺作用。隨后，Barrows等（Barrows?et?al.,2007）驗證了Cry5B對模式線蟲的作用。但是Bt殺蟲晶體蛋白對植物寄生線蟲的研究卻沒有進展。直到2007年和2008年，美國加州大學才將對模式線蟲具有殺蟲效果的Cry6A和Cry5B基因分別轉化到番茄（Li?et?al.,2007;Li?et?al.,2008），接種南方根結線蟲后發現，與對照相比，轉基因番茄的根結數量和卵塊數量均明顯下降，說明Bt殺線蟲基因具有巨大的應用潛力。目前，已發現cry5、cry6、cry12、cry13、cry14和cry21基因對線蟲具有毒殺作用。蘇云金芽胞桿菌的晶體毒蛋白具有廣譜的毒殺線蟲功能，其基因在轉基因抗線蟲育種中將具有廣泛的利用前景，但仍需提高特異毒殺寄生線蟲的活性。如通過轉基因疊加多個抗線蟲功能基因來轉化培育作物廣譜高效的抗線蟲新品種。

利用轉基因技術創造新的抗線蟲植物品系對植物寄生線蟲的防治，環境保護及農業可持續發展具有重要意義。但是，單一基因的轉化，其防效有限。因此，采用轉化作用不同的分子靶標基因有助于提高植物的抗性。由于RNA干涉和Bt對植物線蟲的作用分子靶標不同，將這兩種基因以不同的進行疊加轉化與功能聚合，將可達到高效、廣譜和持久抗線蟲的效果。

發明內容

本發明根據上述領域存在的空白和根結線蟲防治的需要，提供一種高效RNA干涉基因和殺線蟲Bt基因共同作用的抗線蟲方法及品種資源，本發明的技術方案如下：

一種高效RNA干擾聯合Bt基因雙重防治番茄根結線蟲的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）以轉入有RNA干擾載體pCAGC1341-TGPM01RNAi的轉基因番茄為宿主植物轉化外植體，

（2）構建含有外源基因的表達載體，所述外源基因指編碼蘇云金芽孢桿菌的Bt-Cry6A晶體蛋白的基因，

（3）將重組表達載體轉入宿主植物轉化外植體中，篩選陽性轉化子。

所述構建好的重組表達載體指pBI121-06。

所述將重組表達載體轉入宿主植物轉化外植體中，篩選陽性轉化子，其特征在于采用農桿菌介導的轉化，所述農桿菌為根癌農桿菌EHA105。

所述將重組表達載體轉入宿主植物轉化外植體中，篩選陽性轉化子，包括如下步驟：

（1）準備宿主植物轉化外植體，

（2）制備根癌農桿菌轉化液，

（3）根癌農桿菌轉化液侵染外植體，然后共培養，