[發(fā)明專利]高效RNA干擾聯(lián)合Bt基因雙重防治番茄根結線蟲的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210468420.3
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN103088053A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設計）人: 陳國華;王殿東;田雪亮;王運生;茆振川;楊宇紅;謝丙炎
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/32;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

1.高效RNA干擾聯(lián)合Bt基因雙重防治番茄根結線蟲的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）以轉入有RNA干擾載體pCAGC1341-TGPM01RNAi的轉基因番茄為宿主植物轉化外植體，

（2）構建含有外源基因的表達載體，所述外源基因指編碼蘇云金芽孢桿菌的Bt-Cry6A晶體蛋白的基因，

（3）將表達載體轉入宿主植物轉化外植體中，篩選陽性轉化子。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述構建好的重組表達載體指pBI121-06。

3.根據(jù)權利要求2任一所述的方法，所述將重組表達載體轉入宿主植物轉化外植體中，篩選陽性轉化子，其特征在于采用農(nóng)桿菌介導的轉化，所述農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105。

4.根權利要求3所述的方法，所述將重組表達載體轉入宿主植物轉化外植體中，篩選陽性轉化子，包括如下步驟：

（1）準備宿主植物轉化外植體，

（2）制備根癌農(nóng)桿菌轉化液，

（3）根癌農(nóng)桿菌轉化液侵染外植體，然后共培養(yǎng)，

（4）對共培養(yǎng)的外植體進行選擇培養(yǎng)以分化愈傷組織，

（5）生根培養(yǎng)分化的愈傷組織獲得轉基因植株。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，所述準備植物轉化外植體包括外植體預培養(yǎng)，指將取自番茄幼苗的外植體放置在MS+50μg/μl乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基上，光照預培養(yǎng)2天，

所述共培養(yǎng)指采用MS+100μg/μl乙酰丁香酮固體培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)2天，

所述選擇培養(yǎng)指采用MS+2mg/L?6BA+0.2mg/L?IAA+300mg/L羧芐青霉素+50μg/ml卡那霉素+10μg/ml玉米素，26-28℃，光照培養(yǎng)16h，

所述生根培養(yǎng)指長到2～3厘米的分化良好的愈傷組織轉移到生根培養(yǎng)基MS+0.25mg/LIAA+25μg/ml卡那霉素+200μg/ml頭孢霉素上。

6.根據(jù)權利要求5所述的方法，所述制備根癌農(nóng)桿菌轉化液指采用1/2濃度的液體MS＋200μg/μl的乙酰丁香酮為懸浮劑懸浮菌體。