[發明專利]人源抗人表皮生長因子受體抗體及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201210465918.4
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102993305A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 孫志偉;王雙;孫久如;張暢;曾大地;仇瑋祎;常紅艷;范志和;楊濤;范鐵炯
• 申請（專利權）人: 上海賽倫生物技術有限公司;中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K19/00;C12N15/13;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A61K39/395;A61P35/00;A61P29/00;A61P37/02;G01N33/53
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及治療用人源基因工程抗體的制備及應用，主要是涉及特異性針對人表皮生長因子受體（epidemic?growth?factor?receptor，EGFR）的抗體及其編碼基因與應用。

背景技術

表皮生長因子受體（EGFR）是表皮生長因子基因（erbB）家族的一員，在多種腫瘤如乳腺癌，結腸癌，頭頸腫瘤，腎癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌的發展中均具有重要影響。國內外許多研究表明，針對EGFR的抗體可有效地在胞外通過阻斷配體的結合來實現對EGFR信號轉導途徑的抑制，對多種由EGFR過度表達或/和突變所引起的人體腫瘤，尤其是頭頸部鱗狀細胞癌（80％～100%）、結直腸癌(25％～77%)、非小細胞型肺癌(40％～80%)等有較好的療效。表皮生長因子受體是目前研究得較深入且倍受關注的腫瘤治療靶點之一，應用基因工程手段研制抗EGFR的單克隆抗體，是目前腫瘤治療的研究熱點之一。

目前已經有2株抗EGFR的治療性抗體獲得美國FDA的批準，分別是針對EGFR的鼠-人嵌合抗體西妥昔單抗（cetuximab，商品名為愛必妥）和全人抗體帕尼單抗（panitumumab），用于結直腸癌和頭頸部腫瘤治療。2005年，抗EGFR的人源化抗體尼莫珠單抗（nimotuzumab，商品名為泰欣生）獲得了我國藥監局（SFDA）批準的1類新藥證書。針對該靶標的在研抗體包括人源化單抗pertuzumab、人源抗體zalutumumab和Necitumumab等。其結合的抗原表位不盡相同，但均能夠發揮抑制EGFR介導的生物學功能。

人抗體是治療性抗體發展的最終方向，臨床上應用人抗體可最大限度減少抗體的免疫原性、延長抗體在體內的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介導免疫調理、ADCC及CDC效應，進而增強抗體的生物學效應。人抗體的主要研制手段包括抗體庫技術和轉基因小鼠技術。目前，大容量抗體庫技術已經非常成熟，尤其是噬菌體展示抗體庫技術已經成功實現了多株全人抗體的成功上市。在已構建的大容量抗體庫中，CAT公司的半合成抗體庫和Marphosys?AG公司的全合成抗體庫是最具代表性和最為成功的代表。尤其是通過Marphosys?AG公司的HuCAL?GOLD技術已經獲得了數十株具有開發價值的候選抗體，目前進入臨床階段的有17個項目。該技術的最大優勢在于可以通過合理設計對抗體庫進行優化，同時，其抗體框架基因為可替換的盒式結構，便于后期的抗體優化和改造，基于這一優勢，HuCAL庫目前已經將其抗體庫更新至第三代，庫容量達到4.5×10¹⁰，從抗體庫中可篩選到親和力達到pM水平的高親和力抗體。因此，目前在技術上利用抗體庫技術獲得治療性人抗體已經非常成熟，被認為是目前最成功的開發治療性抗體的技術手段之一。申請人通過技術優化和探索，發明了一種高效的DNA連接和轉化的方法，并將其用于大容量噬菌體抗體庫的構建，構建了庫容量達到1.35×10¹⁰的大容量全合成噬菌體單鏈人抗體資源庫（ZL.200910091261.8），并利用該抗體庫篩選獲得了多個針對不同靶標的特異性抗體。本發明所獲得的抗體Ame55即為從抗體庫中篩選獲得。

發明內容

本發明提供了用于治療和預防與EGFR表達相關的疾病，特別是表達EGFR的腫瘤和自身免疫性疾病的抗體治療。

本發明的第一個目的在于提供一種人源抗EGFR抗體及其活性片段的氨基酸序列。

本發明的第二個目的在于提供編碼上述抗體或其活性片段的基因。

本發明的第三個目的在于提供上述抗體及其活性片段在制備治療高表達/過度表達EGFR的惡性腫瘤和自身免疫性疾病藥物中的應用。

本發明運用噬菌體表面展示技術，從大容量全合成人源單鏈抗體庫中，通過多輪的生物淘洗（bio-panning），篩選獲得特異性抗人EGFR的單鏈基因工程抗體(single?chain?variable?fragment,scFv)。在本發明實施例中，將上述抗體輕重鏈可變區分別導入全抗體哺乳動物細胞瞬時表達載體pABL和pABG1中，通過共轉染HEK?293T細胞進行瞬時分泌表達，得到全抗體Ame55。

本發明提供的抗體可變區氨基酸序列模式為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在此，FR1～4代表4個框架區域，CDR1～3代表3個高變區。FR1～4可以是從恒定區序列分離而來（比如人免疫球蛋白輕重鏈類、亞類或亞家族最常用的氨基酸），也可以是從個人抗體框架區分離而來或從不同的框架區基因組合而來。例如Kabat等庫中收錄的眾多人抗體框架區序列。