[發明專利]一種檢測鉻生物可利用度的微生物細胞傳感器

無效

• 申請號: 201210465602.5
• 申請日: 2012-11-19
• 公開（公告）號: CN102925401A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 莊國強;侯啟會;馬安周;崔萌萌;王艷娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12Q1/66;C12Q1/02;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一種檢測水體及土壤中鉻生物可利用度的微生物細胞傳感器的搭建及使用。

背景技術

鉻(Cr)是人體必需的微量元素，在冶金、電鍍、制革和化學品制造等行業被廣泛應用。Cr³⁺是對人體有益的元素，而Cr⁶⁺是有毒的。鉻污染主要是由于在鉻礦、鉻制品的生產過程中對鉻廢水和鉻渣的不合理處理造成的。在土壤中，鉻以Cr³⁺和Cr⁶⁺這兩種形態存在，Cr⁶⁺以陰離子的形態存在，不易被土壤吸附，有較強的移動性，易對植物產生毒性，進而通過農產品進入人體直接危害人體健康，而Cr³⁺極易被土壤膠體吸附以及形成沉淀，移動性差，毒性較低。Cr⁶⁺對人主要是慢性毒害，它可以通過消化道、呼吸道、皮膚和粘膜侵入人體，在體內主要積聚在肝、腎和內分泌腺中。通過呼吸道進入的則易積存在肺部，通過強氧化作用產生毒性。由于Cr⁶⁺毒性較強，直接決定著Cr的毒性大小，對污染環境中Cr⁶⁺進行準確、合理地檢測及評價是進行Cr污染風險評價及修復的前提。

目前監測和檢測重金屬污染物主要有兩種方法：一種是物理化學分析法，如電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)等，其優點是具備高檢測靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設備昂貴，操作復雜，檢測周期長，最重要的一點是，傳統的物理化學方法主要是對環境重金屬總量進行測定，不能檢測重金屬的生物可利用度；另一種方法是基于生物有機體的生物傳感器，其優勢是可以直接反映污染物對生物有機體的毒性及影響。微生物細胞具有易操作，繁殖及生存能力強，易儲存和穩定性高的特點，以微生物細胞為生物學感應元件的微生物細胞傳感器可以極大簡化傳感器的制作過程，提高傳感器的檢測效率。

微生物細胞傳感器的微生物細胞含有一個由特異調控蛋白基因和報告基因組成的重組質粒。當宿主細胞的生長環境中有重金屬離子存在時，宿主細胞通過不同的機制吸收重金屬離子。當重金屬離子進入到胞內后，重組質粒或宿主染色體DNA編碼的轉錄調控蛋白被重金屬離子特異激活，與啟動子綁定或從啟動子上脫落，激活(“turn?on”)或抑制(“turn?off”)啟動子的啟動，進而調控下游報告基因表達，產生可檢測的信號，這種信號的變化強度與重金屬誘導物的濃度密切相關，轉錄調控蛋白對重金屬離子的識別能力和綁定能力決定著微生物全細胞傳感器的檢測特異性和靈敏度。微生物細胞傳感器已成為重金屬生物可利用度監測和風險污染評價的重要工具。

發明內容

本發明的目的在于針對現有的化學檢測方法不能反映鉻的生物可利用度且存在操作復雜、儀器價格昂貴等問題，利用Cmetallidurans?CH34菌株的pMOL28質粒鉻抗性操縱子chr的啟動子序列、調控蛋白基因chrB和商業化質粒pEGMluc的熒光素酶報告基因(luc)，構建了一種微生物細胞傳感器，從而提供了一種具有高靈敏度、低成本等特點的鉻生物可利用度檢測方法。

構建該細胞傳感器的具體操作步驟為：

1、T7啟動子和報告基因的拼接

以商業化質粒載體pRSET?A.B.C為模板，PCR擴增得到T7啟動子片段f1；以商業化質粒載體pGEM-luc為模板，PCR擴增得到熒光素酶報告基因luc片段f2；將片段f1和f2按一定比例混合，以混合液為模板，PCR擴增得到T7啟動子和報告基因luc的拼接片段f3；

2、包含T7啟動子的報告基因導入pUC18質粒：

對pUC18質粒用SacI與BamHI進行雙酶切處理，純化后得到載體v1；對拼接序列f3用SacI與BamHI進行雙酶切處理，純化后得到片段f4；將片段f4連入載體v1，利用大腸桿菌E.coli作為宿主進行轉化，得到含有T7啟動子和報告基因luc的載體v2；

3、載體v2中lac啟動子的去除：

以pUC18為模板，擴增得到不含lac啟動子的pUC18部分序列f5；對f5用SacI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到片段f5′；對載體v2用SacI和HindIII進行雙酶切處理，純化后得到載體v3；將片段f5′連入載體v3，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化，得到含有T7啟動子和報告基因luc且去除lac啟動子的載體v4；

4、載體v4與T7終止子的拼接：