[發(fā)明專利]一種檢測(cè)鎘生物可利用度的微生物細(xì)胞傳感器

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210465178.4
• 申請(qǐng)日: 2012-11-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102911906A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莊國(guó)強(qiáng);侯啟會(huì);馬安周;崔萌萌;王艷娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12Q1/02;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水體及土壤中鎘生物可利用度的微生物細(xì)胞傳感器的搭建及使用。

背景技術(shù)

鎘(Cd)是危及人類健康的有毒物質(zhì)之一，在美國(guó)毒物管理委員會(huì)(ATSDR)黑名單上名列第六，國(guó)際癌癥研究署(IARC)把鎘門類為第一類人類致癌物。鎘污染主要是由于人類長(zhǎng)期進(jìn)行污水灌溉、污泥及含鎘磷肥的大量施用、冶煉等行為造成的。鎘進(jìn)入環(huán)境后即可影響水體和土壤質(zhì)量，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成風(fēng)險(xiǎn)，影響農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量，進(jìn)而被傳遞進(jìn)入食物鏈的頂端而輸脅人體健康。鎘進(jìn)入人體后，主要累積在肝、腎、胰腺、甲狀腺和骨骼中，可使腎臟器官等發(fā)生病變，并影響人體的正常活動(dòng)，造成貧血、高血壓、神經(jīng)痛、骨質(zhì)松軟、腎炎和分泌失調(diào)等病癥。我國(guó)土壤存在嚴(yán)重的重金屬污染問(wèn)題，其中土壤鎘污染面積約為13300hm²，土壤鎘含量在在1～5mg·kg^-1，鎘污染治理工作迫在眉睫，對(duì)污染環(huán)境的鎘進(jìn)行合理、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)是開(kāi)展污染防治工作的重要前提。

目前監(jiān)測(cè)和檢測(cè)重金屬污染物主要有兩種方法：一種是物理化學(xué)分析法，如電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等，其優(yōu)點(diǎn)是具備高檢測(cè)靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，最重要的一點(diǎn)是，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要是對(duì)環(huán)境重金屬總量進(jìn)行測(cè)定，不能檢測(cè)重金屬的生物可利用度；另一種方法是基于生物有機(jī)體的生物傳感器，其優(yōu)勢(shì)是可以直接反映污染物對(duì)生物有機(jī)體的毒性及影響。微生物細(xì)胞具有易操作，繁殖及生存能力強(qiáng)，易儲(chǔ)存和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，以微生物細(xì)胞為生物學(xué)感應(yīng)元件的微生物細(xì)胞傳感器可以極大簡(jiǎn)化傳感器的制作過(guò)程，提高傳感器的檢測(cè)效率。

微生物細(xì)胞傳感器的微生物細(xì)胞含有一個(gè)由特異調(diào)控蛋白基因和報(bào)告基因組成的重組質(zhì)粒。當(dāng)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境中有重金屬離子存在時(shí)，宿主細(xì)胞通過(guò)不同的機(jī)制吸收重金屬離子。當(dāng)重金屬離子進(jìn)入到胞內(nèi)后，重組質(zhì)粒或宿主染色體DNA編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白被重金屬離子特異激活，與啟動(dòng)子綁定或從啟動(dòng)子上脫落，激活(“turn?on”)或抑制(“turn?off”)啟動(dòng)子的啟動(dòng)，進(jìn)而調(diào)控下游報(bào)告基因表達(dá)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，這種信號(hào)的變化強(qiáng)度與重金屬誘導(dǎo)物的濃度密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白對(duì)重金屬離子的識(shí)別能力和綁定能力決定著微生物全細(xì)胞傳感器的檢測(cè)特異性和靈敏度。微生物細(xì)胞傳感器已成為重金屬生物可利用度監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)污染評(píng)價(jià)的重要工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的化學(xué)檢測(cè)方法不能反映鎘的生物可利用度且存在操作復(fù)雜、儀器價(jià)格昂貴等問(wèn)題，利用金黃色葡萄球菌Staphylococcus?aureu?p1258質(zhì)粒鎘抗性操縱子cad的啟動(dòng)子序列、調(diào)控蛋白基因cadC和商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc的熒光素酶報(bào)告基因(luc)，構(gòu)建了一種微生物細(xì)胞傳感器，從而提供了一種具有高靈敏度、低成本等特點(diǎn)的鎘生物可利用度檢測(cè)方法。

構(gòu)建該細(xì)胞傳感器的具體操作步驟為：

1、T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因的拼接

以商業(yè)化質(zhì)粒載體pRSET?A.B.C為模板，PCR擴(kuò)增得到T7啟動(dòng)子片段?f1；以商業(yè)化質(zhì)粒載體pGEM-luc為模板，PCR擴(kuò)增得到熒光素酶報(bào)告基因luc片段f2；將片段f1和f2按一定比例混合，以混合液為模板，PCR擴(kuò)增得到T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因luc的拼接片段f3；

2、包含T7啟動(dòng)子的報(bào)告基因?qū)雙UC18質(zhì)粒：

對(duì)pUC18質(zhì)粒用SacI與BamHI進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到載體v1；對(duì)拼接序列f3用SacI與BamHI進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到片段f4；將片段f4連入載體v1，利用大腸桿菌E.coli作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到含有T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因luc的載體v2；

3、載體v2中l(wèi)ac啟動(dòng)子的去除：

以pUC18為模板，擴(kuò)增得到不含lac啟動(dòng)子的pUC18部分序列f5；對(duì)f5用SacI和HindIII進(jìn)行雙酶切處理后純化得到片段f5′；對(duì)載體v2用SacI和HindIII進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到載體v3；將片段f5′連入載體v3，利用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到含有T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因luc且去除lac啟動(dòng)子的載體v4；

4、載體v4與T7終止子的拼接：