[發明專利]一種豬水泡病病毒VP1 蛋白分泌表達重組質粒及其應用

無效

• 申請號: 201210464946.4
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102978227A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 曹琛福;李中圣;楊俊興;花群義
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/40;C12N15/66;C07K14/08
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩

技術領域

本申請涉及蛋白質表達領域，特別涉及一種豬水泡病病毒VP1蛋白分泌表達的重組質粒、該重組質粒的構建，以及采用該重組質粒進行的豬水泡病病毒VP1蛋白的分泌表達。?

背景技術

豬水泡?。⊿wine?vesicular?disease,SVD）是由豬水泡病毒（swine?vesiculardisease?virus,SVDV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以口和蹄部產生水泡性損傷為特征，其臨床癥狀與口蹄疫、水泡性口炎和豬水泡疹相似，被世界動物衛生組織（OIE）列為A類傳染病。SVDV為小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus）。與人類柯薩奇病毒（Human?coxsackievirus）B5型有非常相近的理化特性、生物學特性及血清學關系。?

目前，我國已經消滅了豬水泡病，因此利用完整病毒粒子建立診斷方法存在潛在的散毒危險，在實踐中不可取。SVDV基因組為一單股正鏈RNA分子，全長為7400bp-7401bp，基因組含一個大的開放閱讀框（ORF），編碼一條由2185個氨基酸組成的多聚蛋白，經翻譯后加工成為各種功能蛋白。SVDV結構蛋白編碼區（P1區）編碼病毒特異性結構蛋白VP1（1D）、VP2（1B）、VP3（1C）和VP4（1A）,外殼蛋白VP1、VP2、和VP3包含中和性抗原位點。非結構蛋白編碼區（即P2和P3）編碼參與病毒復制的非結構蛋白。對SVDV結構蛋白的研究發現，病毒的中和性抗原位點在病毒的外殼蛋白上，其中VP3和VP1是誘導中和性抗體產生的主要抗原蛋白。進一步研究證實，VP3和VP1不僅為序列依賴性抗原多肽，而且還具有抗變性作用。有的研究者認為結構蛋白VP1的87、88位殘基為一中和性抗原位點；有的認為VP1的1～40位氨基酸殘基為一中和性抗原位點；還有人認為VP1的95、98位氨基酸殘基為一中和性抗原位點。以上研究成果表明SVDV的抗原中和位點應集中在結構蛋白VP1上。?

昆蟲細胞表達系統是外源蛋白表達系統的一種，它以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體、昆蟲細胞為受體的表達系統。與細菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統相比，它具有以下特點：安全性高，狀病毒對脊椎動物無感染性；能夠容納較大的外源基因，承載的外源片段可以大到38kb；高效表達外源基因，與其它真核表達系統相比較，桿狀病毒表達系統最突出的特點就是可以便重組蛋白獲得高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50%；具有完備的?翻譯后加工修飾系統，桿狀病毒表達系統具有對蛋白質完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、航基化、信號膚切除及膚段的切割和分解等；重組蛋白具有完整的生物學功能，外源蛋白在細胞內可以進行正確折疊、二硫鍵的搭配，表達產物在結構及功能上接近天然蛋白。?

目前最常用的桿狀病毒表達系統是Bac-to-Bac系統，是Luckow等利用噬菌體復制子構建的一種AcMNPV載體（苜蓿銀蟻夜峨多核型多角體病毒，autogra-phacalifornica?multiple?nuclear?polyhedron-sisvirus），是由轉座子介導的桿狀病毒重組系統，即用外源基因替代多角體蛋白基因而構建重組病毒，所用轉錄調節信號是單一或多個桿狀病毒的啟動子，其中最常用的是PPH啟動子和P10啟動子。轉座過程是在大腸桿菌內進行的，由供體質粒、Bacmid穿梭載體和輔助質粒三部分組成。Bacmid穿梭載體含有F因子復制子(可在大腸桿菌中復制)、卡那霉素抗性基因及Tn7轉座位點attTn7。在供體質粒中，外源基因置于桿狀病毒啟動子之下，兩端分別為Tn7的左右端。以其轉化含Bacmid的大腸桿菌菌株DH10Bac，由輔助質粒提供反式作用發生轉座，而將外源基因轉到Bacmid的attTn7位置。供體質粒中的外源基因在轉座酶作用下，干擾LacZ的表達，所以含有重組質粒（重組Bacmid）的DH10Bac細菌在有IPTG、X-gal的培養板上形成白色菌落。從菌落培養物提取含外源基因的重組Bacmid?DNA，用脂質體介導法轉染昆蟲細胞即可獲得重組病毒以進行外源基因的表達。昆蟲細胞系主要包括Sf9，Sf2I和High?5細胞，三種細胞均為規則的球形，Sf9細胞大小較規則，需要貼壁生辰，Sf21細胞大小不規則，需要貼壁生長，而High?5細胞大小不規則，可以進行懸浮培養，貼壁培養時附著比較松散。Sf9或Sf21因具有較高的轉染效率常用來制備重組病毒，也可以用來擴增重組蛋白；而High?5細胞轉染效率低，但可以利用其懸浮培養特性利用轉瓶大量擴增重組蛋白。?