[發明專利]制備抗體F(ab’)2片段的方法

有效

• 申請號: 201210464842.3
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN103820515B
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 顏重河;蘇暉鈞
• 申請（專利權）人: 財團法人農業科技研究院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/18;A61K39/395
• 代理公司: 北京連和連知識產權代理有限公司11278
• 代理人: 王淑麗

技術領域

本發明關于一種制備抗體F(ab’)₂片段的方法，特別是一種使用陽離子交換樹脂進行純化，且無需使用硫酸銨或硫酸鈉沉淀，以獲得高回收率、高純度的抗體F(ab’)₂片段的制備方法。

背景技術

由于抗體可專一性連結抗原的特性，目前已有許多抗體應用于治療的用途，例如應用于對抗傳染疾病（例如，細菌、病毒、寄生蟲等感染）、癌癥、藥物或是其他異物的治療。在抗體的結構中，以IgG為例，經由胃蛋白酶（Pepsin）的水解作用可將抗體分為F(ab’)₂及Fc兩部分，F(ab’)₂以雙硫鍵結合兩個抗原結合部位，分子量約為110kDa。

由于F(ab’)₂片段移除Fc部分，故可免除抗體與細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、NK細胞和B細胞）的Fc受體的之間的非專一性結合且由于其分子較小，更能有效地滲透組織，此外，由于移除Fc部分，做為檢測時可不受到抗Fc抗體引起的檢測干擾，應用在檢測上有更高的靈敏度，因此在安全性及效能上較IgG更好。

生產抗體F(ab’)₂片段用于治療用途，往往涉及許多目的在保持其有效性的步驟，同時通過純化以減少副作用的發生率和嚴重性。這些步驟包括硫酸銨或硫酸鈉沉淀、酶消化、熱凝、滲濾，近來更用到離子交換及親和性管柱層析。其中，較精致的方法為自血清中純化抗體，然后經蛋白酶水解產生F(ab’)₂片段，再經沉淀法及管柱層析法，將F(ab’)₂片段與Fc水解物及蛋白酶分離。也有自血清先以蛋白酶水解再以分段的硫酸銨或硫酸鈉沉淀加上層析管柱分析。這些制備的步驟可得到有效及安全的F(ab’)₂產 品，但制備的成本相當高。此外，制備方法中如用到硫酸銨或硫酸鈉沉淀的步驟，將相當費時且回收率損失相當高，造成制造成本大幅增加。為了達到避免硫酸銨沉淀步驟的目的，已有相關研究應用Q-Sepharose管柱加上切流過濾系統（Tangential flow diafiltration）來純化F(ab’)₂，可無需使用硫酸銨沉淀（Jones et al.,Journal of Immunological Methods(2003)275(1-2),239-250）。但此純化方法實施時需監控水解的狀態，使抗血清的水解產物除F(ab’)₂外，其他的成分都小于13kDa才能達到純化的目的。此條件除了容易造成過度水解外，也可能只能在特定血清樣品才能實施，其報告中所用的樣品，IgG為其血清蛋白質的主要成分，含量大于其他蛋白質（含白蛋白）成分的總和。

因此，仍需要進一步改善制備抗體F(ab’)₂片段的方法，以縮短制備時間、降低制備成本及提高純化回收率，以獲得高純度及質量的抗體F(ab’)₂片段。

發明內容

本發明提供制備與純化抗體F(ab’)₂片段的方法，以及使用所述方法所制備的包含抗體F(ab’)₂片段的醫藥組合物。

在一方面，本發明提供一種制備抗體F(ab’)₂片段的方法，其包含下列步驟：（1）將抗體以胃蛋白酶（Pepsin）水解以獲得抗體F(ab’)₂片段；（2）將抗體F(ab’)₂片段以過濾系統進行濃縮并置換緩沖液，其中緩沖液的置換使抗體F(ab’)₂片段帶有正電荷；以及（3）將抗體F(ab’)₂片段以陽離子交換管柱進行純化，并以鹽類水溶液置換經純化的抗體F(ab’)₂片段。其中經純化的抗體F(ab’)₂片段不含有血清白蛋白、完整抗體分子及抗體Fc片段。

較佳地，將經純化的抗體F(ab’)₂片段可以第二過濾系統進行濃縮并根據使用需求置換第二緩沖液。

在本發明的具體實施例中，所述過濾系統可為切向流過濾系統（Tangential Flow Filtration System）。

在本發明的具體實施例中，所述緩沖液的pH值小于所述抗體F(ab’)₂ 片段的等電點（pI）值，例如，所述緩沖液可為pH 4.3的醋酸鈉溶液。

在本發明的具體實施例中，所述鹽類水溶液可為濃度約0.1M至約2M的氯化鈉（NaCl）水溶液。