[發明專利]一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法

有效

• 申請號: 201210464636.2
• 申請日: 2012-11-18
• 公開（公告）號: CN102967523A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 馬宏偉;朱志強;汪杰
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: G01N5/02
• 分類號: G01N5/02
• 代理公司: 西安創知專利事務所 61213
• 代理人: 譚文琰

技術領域

本發明屬于生物傳感器技術領域，具體涉及一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法。

背景技術

可卡因(cocaine)，別名古柯堿，是一種從古柯葉中分離出來的的生物堿。可卡因是一種強效局部麻醉劑，脂溶性高，對神經組織親和性良好，屬中樞神經興奮劑。因其毒性大并易于成癮，近來已被其他局部麻醉劑所取代，長期吸食可卡因身體和心理都會產生依賴性，對身體和心理造成極大傷害。可卡因的快速檢測具有重要的意義。傳統檢測方法有高效液相色譜法、氣相-質譜聯用法、薄層色譜法及高效毛細管電泳法等。基于適配體的檢測方法，具有高分辨率與高親和力，彌補了現有抗體的不足。適配體（aptamer）是一類由SELEX篩選技術(指數富集的配基系統進化技術)篩選產生的寡鏈核酸（DNA或RNA）。適配體能特異性地結合小分子，多肽，蛋白，乃至細胞，病毒或寄生蟲等配體。它們可以折疊成功能化的三維結構，并形成口袋結構，并與特定配體結合。適配體可以通過SELEX的方式從單鏈寡核苷酸庫中體外篩選得到。這一過程已經自動化了，目前篩選周期已經從幾個月縮短到幾天。適配體具有以下特點：1）靶分子廣，從小分子到蛋白及有機大分子到細胞層面；2）高分辨率，例如能分辨出分子結構上只有一個甲基差別的茶堿與咖啡因；3）高親和力，篩得aptamer的解離常數可以達到nmol/L水平，甚至pmol/L水平4）可體外合成、易于修飾；5）篩選過程相對簡便、經濟。適配體的出現提供了一種高效識別的研究平臺，展示了良好的應用前景。目前，已有可卡因適配體被篩選出來，并被應用于基于比色法（J.Am.Chem.Soc.2002,124,9678-9679.）以及基于量子點（Anal.Chem.,2009,81,3051–3055）的檢測方法中。石英晶體微天平（Quartz?crystal?microbalance，QCM）是一種利用單結晶石英的壓電電效應的稱重裝置，當施加一個外部電場時，會產生機械振動，當晶片厚度為電極機械振蕩波半波長的奇數倍時，發生共振。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種快速，實時檢測的利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法。該方法采用夾心法的方式在石英晶體微天平的表面固定可卡因的適配體，同時采用表面引發聚合的方式增大信號，能有效的節約人力，有望實現高度自動化。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一、配制DNA濃度為0.2μM的DNA組裝液，然后采用DNA組裝液孵育清洗干凈的QCM芯片，得到表面自組裝DNA的QCM芯片；所述DNA為巰基修飾DNA，DNA序列（SEQ?ID?NO.1）為：5’-TCA?CAG?ATGAGT?AAA?AAA?AAA?AAA-3’；

步驟二、采用濃度為2μM的巰基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步驟一中所述表面自組裝DNA的QCM芯片使芯片表面的多余位點封閉；

步驟三、制備引發劑標記的DNA溶液；

步驟四、采用適配體DNA溶液和步驟三中所述引發劑標記的DNA溶液共同孵育步驟二中封閉后的QCM芯片，用緩沖溶液沖洗孵育后的芯片表面，得到固定有適配體DNA的QCM芯片；將所述固定有適配體DNA的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，然后向反應器中通入緩沖液，待基線平穩后，讀取石英晶體微天平監測到的頻率F1；所述適配體DNA的序列（SEQ?ID?NO.2）為ACT?CAT?CTG?TGA?ATC?TCG?GGA?GACAAG?GAT?AAA?TCC?TTC?AAT?GAA?GTG?GGT?CTC?CC；所述緩沖液為0.1M?pH值為7.0的PBS緩沖液；

步驟五、將步驟四中裝入石英晶體微天平的反應器中的QCM芯片取出，氮氣吹干后置于表面引發聚合反應液中，并將整個反應體系移至手套箱中，室溫下反應2h～4h后將QCM芯片從表面引發聚合反應液中取出，用PBS溶液沖洗QCM芯片，然后用氮氣吹干；

步驟六、將步驟五中吹干后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，然后向反應器中通入緩沖液，待基線平穩后，讀取石英晶體微天平監測到的頻率F2，再向反應器中通入檢測物，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩后讀取監測到的頻率F3，計算頻率F2和步驟四中所述頻率F1的差值ΔF′，頻率F2和頻率F3的差值ΔF″，當ΔF″/ΔF′≥30%時判定檢測物中含有可卡因；所述緩沖液為0.1M?pH值為7.0的PBS緩沖液。