[發(fā)明專利]赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的選育方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210463413.4
• 申請日: 2012-11-17
• 公開（公告）號: CN102911889A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王星云;邱學(xué)良;李雨;王成福;秦海青;李毅
• 申請（專利權(quán)）人: 山東福田藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12R1/645
• 代理公司: 德州市天科專利商標(biāo)事務(wù)所 37210
• 代理人: 房成星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的選育方法。

背景技術(shù)

Yarrowia?lipolytica,中文名被翻譯為解脂耶羅威亞酵母、解脂耶氏酵母、解脂耶羅維亞酵母。赤蘚糖醇工業(yè)化生產(chǎn)是近幾年才興起的，全球的實際產(chǎn)量約6萬噸/年左右。由于赤蘚糖醇是零熱量的天然甜味劑，隨著人們健康理念的增強，在市場上越來越受到人們的青睞。繼而科研院所、高校等科研工作者對于赤蘚糖醇生產(chǎn)技術(shù)，特別是菌種的研究越來越多。

目前，赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的選育方法主要采用化學(xué)誘變、物理誘變的方法，由于現(xiàn)有的選育方法存在誘變方向難以把握，誘變后還有大量的培養(yǎng)檢測篩選工作要做、存在選育程序復(fù)雜，獲得優(yōu)異菌種的時間很長、幾率較低等缺陷，致使赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的選育程序復(fù)雜，選育效率低，菌種活力差、產(chǎn)量低，菌種專一性差、轉(zhuǎn)化率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的選育方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的選育程序復(fù)雜，選育效率低、菌種活力差、菌種專一性差、產(chǎn)量低、轉(zhuǎn)化率低等問題。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案：首先采用基因工程的手段對菌種進(jìn)行改造以增加4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶的基因數(shù)量，然后對培養(yǎng)基組成及配比進(jìn)行優(yōu)化，并添加適量氯化銅，這樣有效提高了菌株中酶的活力。通過以上兩個措施，優(yōu)化培養(yǎng)條件、對原本赤蘚糖醇產(chǎn)量極低的Yarrowia?lipolytica菌株進(jìn)行選育，從而獲得了Yarrowia?lipolytica赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株。其具體選育方法步驟如下：

1、基因工程改造：4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶是赤蘚糖醇生產(chǎn)的關(guān)鍵因子；通過低溫超聲破碎、凝膠色譜分離技術(shù)及全波長分光光度計，分離得到這兩種酶，分析獲得了這兩種酶的基因結(jié)構(gòu)；然后用PCR擴增儀將獲得的這兩種酶的基因片段進(jìn)行大量復(fù)制，PCR擴增的條件：90℃變性30?S、53℃退20?S，72℃延伸30?S；然后將得到的基因分別連接到pBR327質(zhì)粒中；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)arrowia?lipolytica中，使其在細(xì)胞內(nèi)大量拷貝；這樣Yarrowia?lipolytica中4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶的合成量大大增加，有利于赤蘚糖醇的生產(chǎn)。將轉(zhuǎn)化成功的Yarrowia?lipolytica進(jìn)一步富集培養(yǎng)，制成試管斜面在4℃冰箱中保存待用。

2、培養(yǎng)基制備：優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配比按重量計分別為：一水葡萄糖30%-40%，檸檬酸銨1%-2%，七水硫酸鎂0.01%-0.08%，氯化銅0.0003%-0.0006%。然后110℃，滅菌20min。

3、培養(yǎng)條件優(yōu)化：由于培養(yǎng)條件對于微生物的代謝有很大的影響，所以必須對Yarrowia?lipolytica生產(chǎn)赤蘚糖醇的培養(yǎng)條件從溫度、通風(fēng)兩個方面進(jìn)行重復(fù)試驗與優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為：溫度在28℃-31℃時其他副產(chǎn)物最少；每分鐘的通風(fēng)量為料液體積的20%-50%時，Yarrowia?lipolytica細(xì)胞到達(dá)穩(wěn)定期的時間比較短，最終獲得的高產(chǎn)菌，并利于赤蘚糖醇的生產(chǎn)。

通過以上三個步驟就可以從一般的Yarrowia?lipolytica菌株中選育得到滿足生產(chǎn)需要的赤蘚糖醇高產(chǎn)菌。

采用本發(fā)明的積極效果是通過基因工程改造，避免了傳統(tǒng)工藝的盲目性，同時減輕了后續(xù)大量的篩選檢測工作，Yarrowia?lipolytica中4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶的合成量大大增加，有利于赤蘚糖醇的生產(chǎn)。未經(jīng)改造和培養(yǎng)優(yōu)化的菌種，葡萄糖對赤蘚糖醇的摩爾轉(zhuǎn)化率僅為40%，轉(zhuǎn)化效率比較低，改造、優(yōu)化后葡萄糖對赤蘚糖醇的摩爾轉(zhuǎn)化率提高至68%以上。提供的新培養(yǎng)基選育方法明顯提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量，大大提高了赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的選育效率、菌種活力及產(chǎn)量。

具體實施方式

實施例1

將通過PCR儀擴增得到的4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶的基因序列分別連接到pBR327質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)化到Y(jié)arrowia?lipolytica中。PCR擴增的條件：90℃變性30?S、53℃退20?S，72℃延伸30?S。將轉(zhuǎn)化成功的Yarrowia?lipolytica進(jìn)一步富集培養(yǎng)，制成試管斜面在4℃冰箱中保存待用；

制備培養(yǎng)基：一水葡萄糖32%，檸檬酸銨1%，七水硫酸鎂0.04%，氯化銅0.0003%。然后110℃滅菌20min備用；

選取的培養(yǎng)溫度為30℃，每min的通風(fēng)量為料液體積的30%。最終獲得的高產(chǎn)菌使葡萄糖對赤蘚糖醇的摩爾轉(zhuǎn)化率為79%。

實施例2