[發明專利]赤蘚糖醇生產菌的選育方法

無效

• 申請號: 201210463413.4
• 申請日: 2012-11-17
• 公開（公告）號: CN102911889A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 王星云;邱學良;李雨;王成福;秦海青;李毅
• 申請（專利權）人: 山東福田藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12R1/645
• 代理公司: 德州市天科專利商標事務所 37210
• 代理人: 房成星

1.一種赤蘚糖醇生產菌的選育方法，其特征是首先采用基因工程的手段對菌種進行改造，以增加4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶的基因數量，然后對培養基組成及配比進行優化，原料中添加氯化銅，優化培養條件、對原本赤蘚糖醇產量極低的Yarrowia?lipolytica菌株進行選育，從而獲得了Yarrowia?lipolytica赤蘚糖醇高產菌株；其具體選育方法步驟如下：

（1）基因工程改造：4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶是赤蘚糖醇生產的關鍵因子；通過低溫超聲破碎、凝膠色譜分離技術及全波長分光光度計，分離得到這兩種酶，分析獲得了這兩種酶的基因結構；然后用PCR擴增儀將獲得的這兩種酶的基因片段進行大量復制，PCR擴增的條件：90℃變性30?S、53℃退20?S，72℃延伸30?S；然后將得到的基因分別連接到pBR327質粒中；將質粒轉化到Yarrowia?lipolytica中，使其在細胞內大量拷貝；這樣Yarrowia?lipolytica中4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶的合成量大大增加，有利于赤蘚糖醇的生產；將轉化成功的Yarrowia?lipolytica進一步富集培養，制成試管斜面在4℃冰箱中保存待用；

（2）培養基制備：優化得到的培養基配比按重量計分別為：一水葡萄糖30%-40%，檸檬酸銨1%-2%，七水硫酸鎂0.01%-0.08%，氯化銅0.0003%-0.0006%，110℃，滅菌20min；

（3）培養條件優化：由于培養條件對于微生物的代謝有很大的影響，所以必須對Yarrowia?lipolytica的培養條件從溫度、通風兩個方面進行了重復試驗與優化；溫度在28℃-31℃時其他副產物最少；每分鐘的通風量為料液體積的20%-50%時，Yarrowia?lipolytica細胞到達穩定期的時間比較短，最終獲得的高產菌，最終獲得的高產菌，并利于赤蘚糖醇的生產。