[發明專利]一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法

無效

• 申請號: 201210462778.5
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102978233A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 邱立友;孫強;崔繼紅;柴冉;高玉千;戚元成;申進文
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12R1/845
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新;楊海霞

技術領域

本發明屬于脂質體轉化技術領域，具體涉及一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法。

背景技術

目前，絲狀真菌遺傳轉化方法主要有原生質體電轉化法、基因槍轉化法、醋酸鋰介導轉化法、農桿菌介導轉化法、PEG介導的原生質體轉化法和原生質體脂質體轉化法等。這些方法普遍存在操作繁瑣、裝置復雜、轉化率低、轉化子不穩定等缺點。如有些需要制備原生質體，制備過程復雜，包括原生質體電轉化法、PEG介導的原生質體轉化法和原生質體脂質體轉化法。有些方法不需要制備原生質體，但裝置復雜、轉化成本高，如基因槍轉化法。有的僅僅限于少數種類絲狀真菌的轉化，如醋酸鋰介導轉化法。有的轉化率不穩定，轉化效率受多種因素的影響，如農桿菌轉化法轉化效率受農桿菌菌株類型、質粒載體類型及兩者間的匹配情況、培養基成分及誘導條件等多種因素的影響。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術不足，提供一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法，該方法簡便、快捷、轉化率高、轉化子遺傳穩定，不需要制備原生質體，不需要復雜裝置。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法，其包括以下步驟：

一）黑根霉菌絲脂質體轉化：

1）將幼嫩黑根霉濕菌絲與甘露醇水溶液混合后研磨，得菌懸液，備用；

2）將脂質體2000與質粒pEGFP-C1混勻，于-5－5℃放置15－60min，然后轉入到菌懸液中，混勻，于-5－5℃放置15－60min；

3）將步驟2）所得混合液涂抹PDA平板，25－30℃培養1－5天；

二）傳代培養：

4）挑取步驟3）經熒光顯微鏡檢測帶有熒光的轉化子接種于PDA平板上25－30℃培養1－5天，共傳代培養5－8次。

較好的，所述步驟1）具體為：取0.05－0.2g幼嫩黑根霉濕菌絲與0.5－2ml、濃度0.5－1.0mol/l的甘露醇水溶液混合。

所述步驟2）具體為：取30－100μl脂質體2000與30－100μl質粒pEGFP-C1混勻。

和現有技術相比，本發明所述的黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法具有簡便、快捷，轉化率高，轉化子遺傳穩定，且不需要制備原生質體，不需要復雜裝置等優點。用綠色熒光蛋白基因作為選擇標記，可直接進行活體觀察，不需添加其他抗生素等選擇性藥物，并且可簡便地用于監測轉化子中選擇標記基因的消除。

附圖說明

圖1為黑根霉脂質體轉化GFP基因熒光檢測（放大倍數10×20）；

圖2為黑根霉轉化子總DNA電泳圖；G1、G2、G3、G4、G5、G6為轉化后六代黑根霉孢子傳代菌絲DNA，M為hind-Ⅲ，總基因組大約為20kbp；

圖3為黑根霉轉化子總DNA中PCR檢測GFP基因電泳圖；G1、G2、G3、G4、G5、G6為轉化后六代黑根霉孢子傳代菌絲總基因組PCR擴增GFP基因電泳圖，M為1kb?plus；

圖4為黑根霉轉化子southern雜交結果；CK為未轉化黑根霉菌絲基因組，G1、G2、G3、G4、G5、G6為轉化后六代黑根霉孢子傳代菌絲基因組經過Sac?I單酶切后southern雜交圖。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不局限于此。

實施例1

一、實驗材料

1．菌種和質粒匍枝根霉（黑根霉）?Rhizopus?stolonifer

黑根霉（Rhizopus?stolonifer）購自中國科學院微生物研究所中國普通微生物保藏管理中心，編號是3.4098。質粒pEGFP-C1由鄭州大學細胞生物學實驗室饋贈。

2．培養基

PDA培養基（1L）：馬鈴薯200g（去皮切塊加水煮沸15分鐘用四層紗布過濾取濾液），瓊脂（Agar）20g，葡萄糖?20g，水補足1000ml，分裝后高壓蒸汽滅菌。

3.?脂質體

????脂質體2000（Lipofectamine?2000），Invitrogen，Carlsbad,?California，USA。

二、實驗方法

一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法，其包括以下步驟：

一）黑根霉菌絲脂質體轉化：

1）取0.1g幼嫩黑根霉濕菌絲于滅過菌的研缽中，加入1ml、濃度0.6mol/l的甘露醇水溶液，混合后研磨，得菌懸液，轉移至1.5ml離心管中，備用；