[發明專利]Notch1基因突變的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201210461658.3
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102925580A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 王明;范少安
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海唯源專利代理有限公司 31229
• 代理人: 王建國

技術領域：

本發明涉及生物技術和醫學領域，尤其是分子生物學，分子診斷，實時定量PCR技術。

背景技術：

Notch基因最早發現于果蠅，其在哺乳動物中的同系基因編碼單次跨膜的受體蛋白，分子量約300KD；而Notch信息途徑除該受體外，尚有DSL/Jagged配體蛋白、以及具DNA結合活性的輔助因子CSL等成分（4）。當配體分子和相鄰細胞膜上的Notch分子結合后，Notch被蛋白酶降解，釋放出具有核定位信號的胞質區ICN（Intracellular?domain?of?Notch），進入細胞核與CLS結合而調節基因表達；該過程可概括如下：配體→Notch→酶切→ICN→進入細胞核→形成CLS-ICN復合體→促進基因轉錄。Notch信號的靶基因多為堿性螺旋-環-螺旋類轉錄因子（basic?helix-loop-helix，bHLH），它們又調節其它與細胞分化直接相關的基因的轉錄。Notch信息途徑廣泛存在于多種動物體內，在進化過程中高度保守，主要介導細胞的分化抑制信號,在胚胎發育、血細胞發育、腫瘤形成等生理病理過程中起重要作用。

人類具有的4個Notch基因產物中（Notch1-4）的Notch-1，在腫瘤發生過程中（如乳腺癌、胃癌、白血病等）的作用已為研究工作所證實。此外，Notch-1還與腫瘤耐藥密切相關。Notch-1廣泛表達于多種腫瘤細胞,通過促進上皮間質轉換（epithelial-mesenchymal?transition,EMT)、腫瘤干細胞(cancer?stem?cells,CSC)表型的發生和調節微小RNA（microRNAs,miRNA）等途徑,導致腫瘤對多種化療藥物產生抗藥性。因此,Notch-1是對抗腫瘤耐藥的潛在靶點,特異性抑制腫瘤細胞Notch-1活性，聯合化療藥物的應用有望成為有效的腫瘤治療策略。

更進一步地，Notch-1基因突變也與腫瘤發生相關，如約11％的慢性淋巴細胞性白血病（CLL）患者含有Notch-1基因突變；而在超過50％的T細胞性-急性淋巴細胞白血病（T-ALL）患者體內的Notch-1基因發生突變。

高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門的分析算法。使我們可以不必測序直接篩查PCR擴增產物中是否存在遺傳學變異(SNPs,mutations)。

SYBRTM?Green?I對PCR（Polymerase?Chain?Reaction）即聚合酶鏈式反應擴增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因為它是非飽和態結合，染料在熔解過程中可重新結合，使其無法適用于HRM。

羅氏開發了一種新的適用于HRM的染料ResoLight或LC?Green，它有三個優點：飽和染料毒性低；高濃度可以使DNA達到飽和；降低了染料位置重組的可能。

而PCR（Polymerase?Chain?Reaction）即聚合酶鏈式反應產物的高分辨率熔解曲線HRM的要求包括:

儀器:高分辨率高均一性的儀器，確保結果差異僅受DNA模板的影響

試劑:穩定可靠的PCR與HRM染料，確保獲取高分辨率熔解曲線

軟件:高分辨率熔解曲線分析專用軟件

羅氏熒光定量PCR系統LightCycler?Nano?System具有光源好、溫控好、檢測好、加熱快的優點，完全能滿足檢測的要求，這臺儀器也于近期通過了國家藥監局的審批，適用于臨床診斷檢測。

LightCycler?Nano?System是LightCycler?480System的縮小版，480在HRM領域發表的文獻是當前發表文獻最多的實時定量PCR系統：應用領域包括人類疾病、植物、微生物、病毒、藥理、毒理、生理、診斷等；影響因子10分以上5篇，包括Nature,Nature?Methods,NatureGenetics，影響因子5－10分10篇，5分以上文章占總數的18％逐年上升趨勢明顯，已經成為當前qPCR擴展應用的熱點目前常常使用測序法來檢測是否存在突變，但是總結下來，現有的測序法有三個缺點：

第一：靈敏度不高，低比例突變（＜20%）無法檢測；

第二：耗時長，一般需要2-3天；

第三：成本高。

鑒于以上的問題，一種靈敏度高、耗時短、成本低、可操作性能更高的實NOTCH1基因突變的快速檢測方法的發明是勢在必行的。

發明內容：

本發明要解決的技術問題主要是：現有的測序法有三個缺點：