[發(fā)明專利]Notch1基因突變的快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210461658.3
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102925580A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王明;范少安
• 申請（專利權(quán)）人: 上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海唯源專利代理有限公司 31229
• 代理人: 王建國

1.一種NOTCH1基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟：?

在NOTCH1基因突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對突變引物；?

分別設(shè)計(jì)了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突變型，引物分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對兩種模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增對應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段；?

不同比例混合這兩種片段，用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。?

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產(chǎn)物的Tm取決于GC含量。?

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/100最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。?

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種NOTCH1基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟：?

樣本處理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4℃保存；?DNA提取：取200μL抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測；?

qPCR-HRM檢測，包括：對照孔的設(shè)立和檢測重復(fù)孔；10μL反應(yīng)體系構(gòu)成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統(tǒng)儀器中進(jìn)行程序性檢測；?

結(jié)果分析及判定：在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。?

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM檢測的程序包括：95℃變性10分鐘；95℃變性10秒鐘；退火采用探底式，設(shè)置探底退火溫度為55-65℃，每個循環(huán)降低1℃，時間為10秒鐘；72℃延伸30秒鐘；重復(fù)第2步到第四步45個循環(huán);95℃變性60秒鐘；40℃?

變性60秒鐘；設(shè)置高分辨率熔解溫度從60℃到95℃，緩變率是0.05℃/s）。?

7.根據(jù)權(quán)利要求1或5任一所述的方法，其特征在于:所述NOTCH1-6_L1601P突變型目的片段的獲取：突變型目的片段的獲取分為兩步，第一步利用帶有突變位點(diǎn)的突變引物（NOT1F,NOT6MR；和NOT6MF,NOT1R兩對引物）獲得突變位點(diǎn)前后兩段突變片段；第二步將這兩段突變片段連接起來，構(gòu)成NOTCH1-6_L1601P突變型目的片段。?

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述NOTCH1-6_L1601P突變型目的片段的獲取包括：?

突變第一步PCR：以稀釋后的野生型目的片段為模板，分別以NOT1F,NOT6MR；以及NOT6MF,NOT1R兩對引物進(jìn)行兩組實(shí)驗(yàn)，獲得兩個條帶單一的片段；?

突變第一步產(chǎn)物稀釋：將突變第一步獲得的兩段PCR產(chǎn)物稀釋1萬-10萬倍，終濃度約為10-20ng/μL；?

突變第二步PCR：以稀釋后的第一步兩段產(chǎn)物為模板，以NOT1F+NOT1R為引物進(jìn)行第二步PCR，獲得條帶單一的片段；?

突變第二步產(chǎn)物稀釋：將突變第二步獲得的PCR產(chǎn)物稀釋1萬-10萬倍，終濃度約為10-20ng/μL。?

9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一所述的方法，其特征在于：所述M/W＝1/100陽性對照模板的獲取包括：混合99μL野生型模板和1μL突變型模板，配制100μL突變型/野生型（M/W)=1％的混合模板，作為檢測用1％陽性對照模板。?

10.根據(jù)權(quán)利要求1或5任一所述的方法，其特征在于：所述NOTCH1-6_L1601野生型目的片段的獲取：以已知未突變基因組為模板、NOT1F+NOT1R為引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得條帶單一的特異性NOTCH1-6_L1601野生型目的片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度約為10-20ng/μL，作為檢測野生型陰性對照模板用。?