[發明專利]采用光激發化學發光免疫分析對血清中的待測靶物質進行定性與定量檢測的方法

有效

• 申請號: 201210461525.6
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102944672A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 李方和;李時君
• 申請（專利權）人: 李方和
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/76
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 黃行軍;徐紹新

技術領域

本發明涉及生物學領域中的標記免疫分析方法，具體涉及一種采用光激發化學發光（Light?initiatd?Chemiluminescence?Assay,?LiCA）免疫分析對血清中的靶物質進行定性與定量檢測的方法。?

背景技術

均相免疫指全部的反應與結果的觀察均在均一的液相界面進行的免疫學檢測方法，操作簡潔是均相免疫的主要特征。光激發化學發光（LiCA）免疫分析是這類方法的主要代表，亦是目前已經商品化的主要均相免疫技術之一，與酶聯免疫分析（ELISA）、電化學發光免疫分析等固相免疫分析相比，LiCA免疫分析涉及時間分辨熒光，納米微球研究，受體（生物素與親和素）固定，特殊的能量轉遞方式及均相免疫反應等多種前沿科學成果，其技術含量最高，實驗操作最簡潔，但因Hooks效應的影響妨礙了其市場推廣。?

Hooks效應即鉤狀效應，其表現為當反應體系中待測物質（包括抗原或抗體）的濃度升高到一定程度后，檢測信號反而下降或顯著下降，甚至出現假陰性結果，由此造成的后果首先是個別靶物質含量極高的強陽性標本表現出假陰性，其次為陽性標本中大約10～30%左右強陽性標本，被誤判為弱陽或低濃度陽性。?

這種存在于多種血清學檢測中的量（待測物濃度）效（檢測信號）分離現象的產生雖可能與待測免疫分子的結構相關，但反應體系中靶物質與對應免疫物質比例的高度失調是其最主要的原因。這一效應如果發生于某些特殊臨床檢測如血清HBsAg的篩選，則可造成大量臨床標本的定量檢測結果偏離真值，部分強陽性標本測值降低或顯著降低，甚至導致個別具有高度傳染性的強陽性標本出現假陰性結果。如果這種漏檢發生在獻血員篩選，則勢必導致受血者發生輸血相關性肝炎的嚴重臨床事件。鑒于血清HBsAg檢測的范圍及其社會影響面極大，我國已明令禁止“一步法”檢測在獻血員HBV感染者篩選中的應用。?

通過近十余年的努力，對Hooks效應干擾的認識已有很大提高，針對固相免疫實驗中的Hooks效應糾正方法不斷出現。但由于反應方式的大相徑庭，這些方法都不能用于均相免疫?實驗，而有效拮抗均相免疫中Hooks效應影響的方法迄今尚未見報道與公布。?

均相與固相免疫的主要差別，還在于全部的固相免疫試驗在操作上均存在一次甚至多次已反應物與未反應物質的分離，而均相免疫在整個的實驗過程中，尤其是實驗信號的采集完成后，試劑體系中的未反應物單獨或與反應后物質一道存在于同一反應孔（管）中，并很好地保留著與隨后加入靶物質結合的能力，這一差別，為“靶物質疊加反應”在均相免疫實驗中的實施提供了契機。?

此外，免疫學檢測方法的定量檢測范圍通常均較為局限，敏感性越高的試驗方法其定量范圍通常越窄，發光分析雖然在一定程度上能糾正這一現象，然而在兼顧方法敏感性，特異性，穩定性及試劑成本的前提下，其定量檢測范圍亦僅在1000ng/ml左右。如何采用單一檢測對多數靶物質實施全程或亞全程定量分析已經成為制約免疫學技術發展的重要技術瓶頸。?

血清學免疫檢測技術至少包括固相與均相免疫兩類，能接受本專利措施的血清免疫學檢測實驗方法須具備以下前提。①不發生試劑系統對靶物質的結合能力的自消耗；②不發生已反應物與未反應物間的相互分離與清除；③?“未參與反應的試劑”能在系統中較長時期保留與靶物質反應并生成檢測信號的能力。符合上述條件的實驗方法多集中在均相免疫實驗，光激發化學發光免疫分析（LiCA）是其中的重要代表。?

現有血清免疫學試驗盡管存在上述缺點，但在技術發展上均達到或基本達到在當前物質與技術條件下該技術可具備的最佳的狀態。包括合理的實驗步驟與反應條件，完善的試驗操作與檢測系統（儀器），穩定的試劑質量，以及良好地檢測品質（高度的特異性敏感性與穩定性）等。部分還預留進一步完善與發展的技術方向。本專利發明以上述各實驗方法的最新技術成果為基礎，全盤接受上述試驗技術發展所取得的優良技術特征，不排斥正在或將要進行的適合本專利技術實施的任何技術革新與改造，為適應本專利實施所進行的相關改造（包括試劑改造與實驗儀器改造）亦以不妨礙原有試驗的操作以及技術特征的充分發揮為前提。?

發明內容

本發明的目的是對現有的光激發化學發光免疫分析方法進行改進，提供一種能糾正Hooks效應并擴大定量檢測范圍的光激發化學發光免疫分析方法。?

上述目的是通過以下技術方案實現的：?