[發明專利]復制缺陷型沙粒病毒載體

在審

• 申請號: 201210461234.7
• 申請日: 2008-12-22
• 公開（公告）號: CN103255169A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 丹尼爾·D·平舍韋爾;盧卡斯·弗拉茨;安德烈亞斯·貝格塔勒;羅爾夫·青克納格爾
• 申請（專利權）人: 蘇黎士大學
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;A61K48/00;A61P31/04;A61P31/12;A61P33/00;A61P37/02;A61P35/00;A61P37/08;A61P3/04;A61P3/10;A61P19/06;A61P25/28;A61P25/16
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;鄭斌

本申請是中國專利申請200880123157.6的分案，后者是2008年12月22日提交的PCT申請PCT/EP2008/010994于2010年6月28日進入中國國家階段的申請。

技術領域

本發明涉及適合用作疫苗或基因治療之載體的經基因修飾沙粒病毒(arenavirus)以及利用這些病毒進行疫苗接種和疾病治療的方法。?

背景技術

預防性疫苗代表了現代醫學最成功的篇章之一，其使天花在世界上消失，并且控制了脊髓灰質炎、麻疹和許多其他破壞性感染性疾病。最近，出現了預防癌癥的疫苗，人們正在努力開發治療形式的“疫苗”，希望其可用于感染和惡性腫瘤。歷史上，疫苗接種策略包括多種方法：從最開始利用野生型傳染源和自(再)接種腫瘤細胞，然后用減毒活傳染劑和死腫瘤組織，隨著時間的推移，臨床醫學越來越傾向于使用分別來自傳染源或腫瘤的(惰性)蛋白質和/或其它提取物(一般稱為“抗原”)。這個逐漸的過程代表了尋找更安全的疫苗制劑的過程，然而，這常常伴隨著疫苗效力的相對損失。近年來，生物工程技術的發展使得另一種方法成為可能，所述方法目前被廣泛認為是最具有前景的方法之一：給用作“船渡”(稱為“載體”)的傳染源裝備來自所選病原體或腫瘤的抗原。由此，在所述載體賦予的強免疫增強(“免疫原性”)情形下，疫苗接種者的免疫應答識別目的抗原。?

這種“載體方法”已經可在組織培養物水平下將外源基因直接引入活細胞中，也可在多細胞生物(包括人)中將外源基因直接引入活細胞中，因此，載體還可用于在培養細胞中或在基因治療中表達基因。?

目前有很多載體用于實驗研究中，包括疫苗接種和基因治療，最終目的是優化針對臨床應用(疫苗和基因治療)或生物技術(細胞培養物中的基因轉移)的效力和安全性。?

一般認為，載體常具有其來源生物(例如病毒)的一般性狀。因此，開發用于載體設計的新病毒家族提供了發現新的性狀組合的前景，所述性狀組合可賦予這種新型載體以空前的能力以及在生物醫學應用中的?相應應用。然而，載體設計需要將所用生物的安全性考慮在內，所以必須提出如何以不干擾期望的性狀(比如作為疫苗施用的免疫原性)的方式消除所述生物的致病潛能的策略。?

70多年以來，已知一般的沙粒病毒(特別是淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV))能引發特別強和持久的體液和細胞介導的免疫應答。值得注意的是，盡管如此，針對病毒包膜糖蛋白(GP)的保護性中和抗體免疫性極低，感染導致的針對再感染的抗體介導保護作用極低(如果有的話)。而且，幾十年來已經穩固地確定，由于其非細胞溶解性(不破壞細胞的特性)，沙粒病毒可在某些條件下于動物中維持長期的抗原表達而不引起疾病。最近，已經描述了用于操作感染性沙粒病毒基因組的反向遺傳系統(L.Flatz，A.Bergthaler，J.C.de?la?Torre，and?D.D.Pinschewer，Proc?Natl?Acad?Sci?USA?103：4663-4668，2006；A.B.Sanchez?and?J.C.dela?Tore，Virology?350：370，2006)，但是，到目前為止，沙粒病毒還未被用作疫苗載體。這主要是因為兩個主要障礙：i)沙粒病毒可引發極嚴重的感染，這可隨后導致嚴重的疾病和免疫抑制。ii)還不能引入選定的外源抗原。?

發明概述

本發明涉及一種感染性沙粒病毒顆粒，其被改造成包含能在被感染細胞中擴增和表達其遺傳信息但不能在正常的非基因工程細胞中進一步產生感染性后代顆粒的基因組。?

更具體地，本發明涉及這樣的沙粒病毒顆粒，其包含可以編碼目的蛋白或調節宿主基因表達的額外的核糖核酸。?

本發明的沙粒病毒包含經修飾的基因組，其中：?

i)沙粒病毒的四個開放閱讀框即糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、基質蛋白Z和RNA依賴性RNA聚合酶L中的一個或更多個被除去或突變，

以防止感染性在正常細胞中傳播，但是仍然允許在這些細胞中進行基因表達；

ii)引入編碼一種或多種蛋白質或調節宿主基因表達的外源核糖核酸，并且通過沙粒病毒的四個啟動子(S節段的5’UTR和3’UTR以及?L節段的5’UTR和3’UTR)之中的一個或更多個進行轉錄，或者通過額外引入的可分別被病毒RNA依賴性RNA聚合酶、細胞RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III讀出的啟動子進行轉錄，其中編碼蛋白質或調節宿主基因表達的核糖核酸可自身進行轉錄或通過與沙粒病毒蛋白質開放閱讀框融合而被通讀(read-through)；以及任選地