[發(fā)明專利]一種用4-硝基-1-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)制備β-半乳糖苷酶顯色底物的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210461131.0
• 申請(qǐng)日: 2012-11-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102977160A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖飛;楊曉蘭;黨紀(jì)政;劉紅博;張奕;李元麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07H15/203
• 分類號(hào): C07H15/203;C07H1/00;G01N21/31;G01N33/52
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及β-半乳糖苷酶新型顯色底物合成方法及在測(cè)定β-半乳糖苷酶活性中的應(yīng)用，包括但不限于檢測(cè)β-D-半乳糖苷酶活性和基于檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的免疫分析；此類新型顯色底物用于中性或偏酸性連續(xù)跟蹤β-半乳糖苷酶反應(yīng)過(guò)程，在測(cè)定顯色產(chǎn)物吸收靈敏度方面明顯優(yōu)于用4-硝基苯酚類顯色團(tuán)制備的顯色底物。?

背景技術(shù)

光度法測(cè)定β-半乳糖苷酶活性主要有終點(diǎn)法和連續(xù)跟蹤過(guò)程法；在自動(dòng)化分析領(lǐng)域，連續(xù)跟蹤酶反應(yīng)過(guò)程測(cè)定酶活性有明顯優(yōu)勢(shì)；適合連續(xù)跟蹤β-半乳糖苷酶反應(yīng)過(guò)程的顯色底物包含對(duì)-硝基苯基-β-D-半乳糖苷[Biochemical?Zeitschrift，1960，333：209]、4-甲基扇形酮基-β-D-半乳糖苷[J?Organ?Chem，1962，27：1074]、氯酚紅基-β-D-半乳糖苷等。這些顯色底物在pH＜7時(shí)對(duì)應(yīng)顯色產(chǎn)物消光系數(shù)都很低，都不適合在pH＜7的緩沖液中連續(xù)跟蹤β-半乳糖苷酶反應(yīng)過(guò)程；而4-硝基-1-萘酚在pH5.5以上消光系數(shù)都很高(圖1)，顯著高于4-硝基苯酚(pNP)和鄰硝基苯酚(oNP)，用于合成這類顯色底物在測(cè)定顯色產(chǎn)物靈敏度上更有優(yōu)勢(shì)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明用4-硝基-1-萘酚類顯色團(tuán)制備β-半乳糖苷酶的新型顯色底物；這些顯色底物被酶水解釋放的顯色產(chǎn)物吸收峰在460nm附近，且在pH5.5到pH7.0之間的摩爾消光系數(shù)比4-硝基苯酚高1倍以上，在偏酸性的條件下連續(xù)跟蹤β-半乳糖苷酶的反應(yīng)過(guò)程具有明確優(yōu)勢(shì)，便于高靈敏度自動(dòng)化分析；在pH＞7.0以上緩沖液中，此類新型顯色底物所得顯色產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)也顯著高于4-硝基苯酚。?

4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷也有合成方法報(bào)道，如文獻(xiàn)[Tetrehedron?Letter，2007，48(6)：993-996]、[Journal?of?Agricultural?and?Food?Chemistry，2007，55(4)：1405-1410]、[CarbonhydrateResearch，2009，344(4)：511-515]、[Carbonhydrate?Research，2009，344(16)：2245-2249]所述；主要有三種方法合成β-D-半乳糖苷：?

方法1：β-D-吡喃半乳糖在堿催化或酸催化下與短鏈酰化劑在有或無(wú)溶劑條件下反應(yīng)制得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯為中間體1；中間體1與HBr乙酸溶液反應(yīng)生成α-溴代-D-吡喃半乳糖四乙酸酯為中間體2；中間體2與酚類顯色團(tuán)在碳酸鉀的丙酮溶混懸液中反應(yīng)生成酚類對(duì)應(yīng)的β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯為中間體3；此中間體3在堿催化下甲醇溶液中脫乙酰基得目標(biāo)顯色底物β-D-吡喃半乳糖苷；所用酰化劑主要是乙酰氯或乙酸酐、甲酰氯或甲酸酐。?

方法2：上述中間體2與4-硝基-1-萘酚或其衍生物在相轉(zhuǎn)移催化劑如四丁基溴化胺(TBAB)和無(wú)機(jī)堿包括但不限于氫氧化鈉作用下反應(yīng)制得新型β-D-半乳糖苷類顯色底物。?

方法3：中間體1在三氟化硼-乙醚及三丁基氧化錫催化下，在苯中與4-硝基-1-萘酚直接反應(yīng)得到β-半乳糖苷酶的新型β-D-半乳糖苷類顯色底物。?

4-硝基-1-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)的β-半乳糖苷酶顯色底物至今未見(jiàn)報(bào)道；理論上可用類似于4-硝基苯酚反應(yīng)制備，故有上述方法1、方法2和方法3應(yīng)都適用。?

本發(fā)明所述β-半乳糖苷酶的新型顯色底物合成方法及應(yīng)用包括如下內(nèi)容：?

a本發(fā)明所涉及4-硝基-1-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)的β-半乳糖苷酶顯色底物為β-D-吡喃半乳糖苷，具有如下的結(jié)構(gòu)通式：?

R＝-COOH，-GOCH₃，-NO₂，-CI?

其中，R基團(tuán)為-H，-COOH，-COCH₃，-NO₂，-Cl或-Br，處于5，6，8中任一或多個(gè)位置；這些衍生物包括4-硝基-1-萘酚的單取代或多取代衍生物。?

b制備β-半乳糖苷酶的上述新型顯色底物，包括如下合成步驟(圖2)：?

b1β-D-吡喃半乳糖在堿或酸催化下與來(lái)自短鏈羧酸包括但不限于甲酸和乙酸的酰化劑在有或無(wú)溶劑條件下反應(yīng)制得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯為中間體1；此步驟中所用堿類催化劑包括但不限于碳酸和醋酸的無(wú)水鈉鹽和鉀鹽、吡啶和三乙胺；所用酸催化劑包括但不限于磷酸、硫酸、對(duì)甲苯磺酸；所用酰化劑包括但不限于甲酸酐或甲酰氯、乙酸酐或乙酰氯、丙酸酐或丙酰氯；所用溶劑包括但不限于丙酮或四氫呋喃或二者的混合物；?