[發明專利]核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子位點多態性

無效

• 申請號: 201210460954.1
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN103820526A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 胡琳;江建輝;侯建華;徐高連;孫悅
• 申請（專利權）人: 蘇州優貝沃生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/558
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明涉及利用核酸試紙條法檢測切除修復交叉互補基因1(excision?repair?cross-complementing?gene?1,ERCC1)?第118位密碼子多態性的方法。更具體地說，是利用擴增技術(PCR&AS-PCR)和核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條技術進行ERCC1第118位密碼子位點多態性的快速檢測。?

背景技術

鉑類藥物的主要作用機制是與DNA?上的鳥嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶結合形成鉑-DNA加合物，導致DNA的鏈間交聯或鏈內交聯，引起DNA損傷，從而導致細胞死亡。DNA修復能力的差異將直接導致腫瘤細胞對DNA相關細胞毒性藥物敏感性的個體差異。ERCC1基因第118?密碼子Asn-Asn?具有多態性，?核苷酸序列由AAC?突變為AAT，?該無義突變能夠影響?ERCC1?蛋白的表達水平，C?→?T?的突變提高了ERCC1?mRNA?的表達水平，增強DNA?修復能力而導致鉑類耐藥。有研究顯示，含有野生型ERCC1?序列的人卵巢癌細胞株比變異型細胞株對鉑類藥物敏感要高。同時，ERCC1第118位密碼子的多態性還可能影響患者的生存率和療效。ERCC1第118位密碼子上的一堿基由C到T的變異與化療效果明顯相關：具有C/C基因型患者（54/109,?50.4%）的中位生存時間為486天（95%CI，333-x），而變異型C/T（45/109,?42.1%）或T/T（8/109,7.5%）的中位生存時間為281天（95%CI，214-376）。?

目前用于ERCC1第118位密碼子位點多態性檢測的方法大多以PCR技術為基礎，與熒光、質譜法、基因芯片或直接測序等方法結合。但這些方法大多操作復雜、價格昂貴、檢測時間長，而且需要大型的儀器設備為前提，因此并不適合于基層醫院。?

發明內容

為了解決ERCC1位點多態性檢測方法大多操作復雜、價格昂貴、檢測時間長，而且需要大型的儀器設備的問題，本發明利用擴增技術(PCR&AS-PCR)和核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條技術（專利號CN1234567890）進行ERCC1第118位密碼子位點多態性的快速檢測。?

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：?

1、發明原理：本發明就是在PCR擴增靶模板的基礎上，利用帶標記的引物進行等位基因特異性擴增（Allele?specific?Polymerase?Chain?Reaction，AS-PCR），并最終利用核酸試紙條進行ERCC1第118位密碼子檢測的技術。其檢測的主要原理是根據抗原和其特異性抗體的免疫學特異性結合，將核酸片段固定在核酸檢測試紙條上，然后通過可視的呈色乳膠顆粒在試紙條上顯色而檢測出結果。其反應原理和步驟如圖1：

在PCR?&?AS-PCR核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子多態性中主要包括用于PCR擴增的特異性PCR擴增引物，一條5’末端帶生物素標記的等位基因特異性引物，一條3’末端帶FITC標記的特異性探針。PCR?&?AS-PCR核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子多態性基因型主要包括以下幾個步驟：

a:取樣,被檢者外周靜脈抗凝血（凍存）200ul，應用杭州優思達生物技術有限公司所生產的微量DNA快速提取試劑盒進行核酸提取，用以基因擴增。

b：先對包含ERCC1第118位密碼子多態性位點的靶模板通過PCR進行擴增，這一步驟中的PCR擴增并不對ERCC1第118位密碼子多態性的堿基類型進行區分，只是為了達到富集靶序列的目的，同時進行PCR擴增的引物并不進行任何的標記；?

其特征在于：

c：在步驟b的基礎上，利用AS-PCR根據ERCC1第118位密碼子多態性基因型的堿基類型進行特異性擴增，在適當的Tm情況下，只有當5’末端標記抗原A的等位基因特異性引物與步驟2中擴增產物上要檢測的含ERCC1第118位密碼子多態性片段完全互補時，該引物才能在DNA聚合酶的作用下進行延伸，其延伸產物能與反應液中3’末端標記抗原B的探針進行結合。