[發明專利]核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子位點多態性

無效

• 申請號: 201210460954.1
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN103820526A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 胡琳;江建輝;侯建華;徐高連;孫悅
• 申請（專利權）人: 蘇州優貝沃生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/558
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 汪旭東

1.一種核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子位點多態性，

a,取樣，凍存的被檢者外周靜脈抗凝血200ul，用微量DNA快速提取試劑盒進行核酸提取；

b：先對包含ERCC1第118位密碼子多態性位點的靶模板通過PCR進行擴增，同時進行PCR擴增的引物并不進行任何的標記；

其特征在于：

c：在步驟b的基礎上，利用AS-PCR根據ERCC1第118位密碼子多態性基因型的堿基類型進行特異性擴增，

在滅菌的0.2ml?PCR管中，在20ul的反應體系中，針對不同的基因型分加入不同的PCR擴增引物和探針；

PCR?&?AS-PCR核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子多態性反應體系：

模板：一個被檢者基因組DNA，

PCR引物：181PF和181PR??各0.2-2微摩，??????

標記的引物：181D5F-C/181D5G-A??各0.1-1微摩，

特異性探針：181D3B???0.1-1微摩，

dNTP：??????????????????????????0.2-0.5毫摩

(NH₄)₂SO₄????????????????????????10毫摩

KCl?????????????????????????????10毫摩

Tris-HCl（PH?9.0）??????????????10毫摩

Triton-100??????????????????????1.0%

MgCl₂????????????????????????????1.5-3毫摩

Taq?DNA聚合酶：?????????????????1-5單位

總體積為20微升

短暫離心后進行PCR循環。PCR循環參數為95?℃?5min；93-96?1min；60-72℃?1min；72?℃?2min；30-50個循環；93-96℃?30s；45?-55℃?1min；2-10個循環；95?℃?5min；

在AS-PCR擴增線性擴增過程中，將反應的退火溫度將到適合181D5F-C?和181D5G-A延伸的溫度；

d：在試紙條上，將特異性抗體即抗A抗體吸附于乳膠顆粒，在乳膠顆粒表面形成抗體包被；將另一無色特異性抗體即抗B抗體，以線條狀固定于膜上，形成檢測線；

e：檢測結果：將反應產物全部滴于核酸試紙條的加樣處，加上100ul的緩沖液，帶抗原A和抗原B的雜交產物首先與顆粒表面的抗體A結合，形成抗原B－寡核苷酸鏈抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物，有色的復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動，當復合物遇到固定于膜上的抗體B線條時，待檢的抗原B－寡核苷酸鏈抗原A-顆粒抗體A復合物與線條上的抗體B結合，形成線條抗體B－抗原B－寡核苷酸鏈抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物，有色的線條抗體B－抗原B－寡核苷酸鏈抗原A-顆粒抗體A的顆粒復合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條；

2A：核酸試紙條檢測的結果：1.?TT純合子；2.?CC純合子。

2B：對應的測序結果，劃紅線的堿基為所要檢測的位點：1.?TT純合子；2.?CC純合子。

2.根據權利要求1所述的核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子位點多態性，其特征在于，檢測ERCC1的樣本為多個。

3.根據權利要求1或2所述的核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子位點多態性，其特征在于，在步驟c中，PCR?&?AS-PCR核酸試紙條法檢測ERCC1第118位密碼子多態性反應體系里，PCR引物：181PF和181PR??各0.2微摩，標記的引物：181D5F-C/181D5G-A??各0.1微摩，特異性探針：181D3B???0.1微摩，dNTP??0.2毫摩??MgCl₂?2.5毫摩，Taq?DNA聚合酶2單位，PCR反應程序為：95℃,?5分；94℃,?20秒；60℃,?20秒；72℃,?20秒；40循環；94℃,?20秒；45℃,?20秒；5循環。