[發(fā)明專利]枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotZ作為分子載體在芽孢表面展示外源蛋白的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210460863.8
• 申請(qǐng)日: 2012-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103014054A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊瑞金;王賀;華霄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用枯草芽孢桿菌芽孢表面展示目的蛋白的方法。更特殊地涉及枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotZ作為分子載體實(shí)現(xiàn)芽孢表面展示目的蛋白。

背景技術(shù)

芽孢表面展示技術(shù)是指通過(guò)基因工程的手段將外源蛋白或抗原固定在芽孢表面并實(shí)現(xiàn)活性表達(dá)的技術(shù)。相對(duì)于噬菌體表面展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)和細(xì)菌表面展示技術(shù)，芽孢表面展示技術(shù)雖起步較晚，但由于其穩(wěn)定性和安全性高的特點(diǎn)已引起了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。由于對(duì)枯草芽孢桿菌的遺傳學(xué)背景和芽孢結(jié)構(gòu)組成了解地很透徹，所以通常選擇枯草芽孢桿菌的芽孢作為展示載體，而不是蘇云金芽孢桿菌或炭疽芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為GARS(Generally?Recognized?as?Safe)菌種之一，因而它被廣泛應(yīng)用于生物和食品等領(lǐng)域。枯草芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏等逆環(huán)境誘導(dǎo)下，自身營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞會(huì)分化形成一種休眠體即芽孢。芽孢一般由核心、皮層、芽孢衣殼和芽孢外壁組成，其中芽孢衣殼又由基底層、內(nèi)層、外層和殼構(gòu)成。外層的芽孢衣殼主要由疏水的衣殼蛋白構(gòu)成，目前發(fā)現(xiàn)有超過(guò)70種以上的衣殼蛋白。截止目前，已報(bào)道了芽孢衣殼蛋白CotB、CotC、CotG、CotX和OxdD可被用作分子載體實(shí)現(xiàn)外源蛋白在芽孢表面展示。CotB和CotC一般用來(lái)錨定抗原在芽孢表面制備重組芽孢疫苗，而CotG則常被用來(lái)錨定外源酶蛋白在芽孢表面制備全細(xì)胞催化劑。盡管已經(jīng)報(bào)道了四種芽孢衣殼蛋白可用作分子載體，但是為了擴(kuò)大芽孢表面展示技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，探索新的芽孢衣殼蛋白作為分子載體已成為制約該技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

Hinc等(Hinc?K，Isticato?R，Dembek?M，et?al.Micro?Cell?Fact，2010，9：2)利用芽孢衣殼蛋白CotB、CotC和CotG分別融合幽門(mén)螺桿菌尿素酶A單位使其錨定在枯草芽孢桿菌芽孢表面。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)與CotB融合時(shí)，每個(gè)芽孢中融合蛋白的分子數(shù)約是1×10³；而當(dāng)與CotC融合時(shí)，每個(gè)芽孢中融合蛋白的分子數(shù)高達(dá)7～15×10³，但是融合蛋白卻不能展示在芽孢表面；尿素酶A單位與CotG融合的結(jié)果同CotC差不多，而且融合蛋白的某些部位似乎發(fā)生了再加工的現(xiàn)象。

不同的芽孢衣殼蛋白的分子結(jié)構(gòu)以及在芽孢中的存在形式的差異，導(dǎo)致不同芽孢衣殼蛋白做為分子載體展示外源蛋白的能力和效率也不一樣。此外，為了實(shí)現(xiàn)芽孢表面展示技術(shù)同時(shí)展示多種抗原或酶以制備多價(jià)重組疫苗或幾種酶協(xié)調(diào)作用的全細(xì)胞催化劑，也需要更多的芽孢衣殼蛋白作為分子載體。所以，篩選或發(fā)現(xiàn)新的能高效展示外源蛋白的芽孢衣殼蛋白用作分子載體則尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是篩選新的芽孢衣殼蛋白CotZ作為分子載體，通過(guò)芽孢表面展示技術(shù)將外源蛋白展示在枯草芽孢桿菌芽孢表面，以制備枯草芽孢桿菌重組芽孢。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotZ作為分子載體在芽孢表面展示外源蛋白的應(yīng)用。具體的，是將作為分子載體的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotZ的編碼基因cotZ，與外源目的蛋白基因的編碼序列進(jìn)行融合，構(gòu)建能夠融合表達(dá)重組蛋白的整合型質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生表面能夠展示外源目的蛋白的重組芽孢。

本發(fā)明選擇芽孢衣殼蛋白基因cotZ(Genbank序列號(hào)：Q08312)作為表面展示外源目的蛋白的分子載體，選擇具有保護(hù)性抗原和具有催化活性的酶蛋白基因?yàn)橥庠椿颍跃哂修D(zhuǎn)化能力且可產(chǎn)生芽孢的枯草芽孢桿菌菌株作為重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株，如Bacillus?subtilis?168及其衍生菌株(BGSC，department?of?Biochemistry，The?Ohio?State?University，West?12^th?Avenue，Columbus，Ohio，43210，USA)。

本發(fā)明涉及芽孢衣殼蛋白基因cotZ，該基因與外源目的蛋白基因的編碼序列融合后構(gòu)建整合型重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒中含有芽孢衣殼蛋白基因cotZ的啟動(dòng)子、不含終止密碼子的編碼序列以及與外源目的蛋白基因融合的重組片段，它可在枯草芽孢桿菌形成芽孢時(shí)分別表達(dá)融合蛋白。

本發(fā)明涉及的構(gòu)建的融合表達(dá)重組蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌后得到的重組菌株，經(jīng)誘導(dǎo)形成的重組芽孢表面能夠展示外源目的蛋白，可通過(guò)免疫熒光顯微鏡或其它手段檢測(cè)芽孢表面展示的重組蛋白。