[發明專利]來自冷凍的臍帶組織的活細胞

在審

• 申請號: 201210460386.5
• 申請日: 2006-12-21
• 公開（公告）號: CN103173401A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 簡·恩尼斯;拉胡爾·薩魯加瑟;約翰·E·戴維斯
• 申請（專利權）人: 簡·恩尼斯;拉胡爾·薩魯加瑟;約翰·E·戴維斯
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 杜艷玲;孟慧嵐

本申請是國際申請日為2006年12月21日、國際申請號為PCT/CA2006/002092、進入國家階段的申請號為200680053313.7、發明名稱為“來自冷凍的臍帶組織的活細胞”的PCT申請的分案申請。

發明領域

本發明聚焦于從臍帶(UC)結締組織中收獲一群快速增殖的人細胞；處于成骨、軟骨形成、生脂和生肌條件中的這樣的細胞的培養物；如它們缺少細胞表面組織相容性抗原所示的，證明了在這些細胞群中高百分比的細胞是無免疫能力的；以及這些細胞用作多能祖細胞的來源用于多種基于細胞的治療的能力。更特別地，本發明涉及冷凍的組織作為上述有價值的祖細胞來源的應用。

發明背景

UC是在原腸胚形成(三胚層形成)后所最初形成的一種結構。當折疊開始時，胚盤經卵黃和尿囊血管通過原始中腸(胚胎起源)與原始卵黃囊(胚胎外起源)相連接，所述血管接著發育形成臍血管(Haynesworth等，1998；Pereda和Motta，2002；Tuchmann-Duplessis等，1972)。這些血管被稱為臍帶膠質(WJ)的通常被認為是主要由胚外來源的原始間充質組織所支持并被其環繞(Weiss，1983)。在妊娠期間，從該早期開始UC生長直至變成在分娩中所見的30-50cm的臍帶。因此，預計WJ不僅含有已在文獻(參見下文)中描述的成纖維細胞樣或肌成纖維細胞樣細胞，還含有能產生在胚胎和胎兒發育期間為支持臍帶生長所必需的擴增體積的WJ的細胞的祖細胞群。

Thomas?Wharton首次描述了WJ，其在1656年出版了他的論文Adenographia(Wharton?TW.Adenographia.Freer?S.譯(1996).Oxford，U.K.：Oxford?University?Press，1656；242-248)。隨后，其被定義為由分散于由包括透明質酸在內的蛋白聚糖(Schoenberg等，1960)和不同類型的膠原(Nanaev等，1997)組成的無定形基質中的細胞所組成的膠狀的、松散的粘液性結締組織。分散于該基質中的細胞已被描述為是在萎陷的臍帶中呈星狀以及在擴張的臍帶中拉長的“成纖維細胞樣”(Parry，1970)。最初在基質中觀察到平滑肌細胞(Chacko和Reynolds，1954)，盡管Parry(1970)對此有爭議，他將它們描述為在表面上類似于平滑肌細胞的有些“不尋常的成纖維細胞”。此后，在1993年Takechi等(1993)對這些細胞進行免疫組織化學研究之前，很少進行鑒定這些細胞的工作。他們將這些細胞描述為是“在無定形基質中“具有長胞質突的紡錘狀或星狀以及膠原纖維波形網絡”的“成纖維細胞樣”(Takechi等，1993)。為了免疫組織化學染色，他們使用了針對肌動蛋白和肌球蛋白(胞質可收縮蛋白)、波形蛋白(胚胎間充質起源的成纖維細胞特有的)以及結蛋白(特異于肌原性起源的細胞)的第一抗體，以便確定哪些類型的肌球蛋白與WJ成纖維細胞相關。他們觀察到高水平的化學上可提取的肌動球蛋白；盡管成纖維細胞含有胞質肌動球蛋白，但是它們對肌動蛋白或肌球蛋白沒有染色，而WJ成纖維細胞則對兩者染色陽性。此外，觀察到對于波形蛋白和結蛋白兩者染色陽性，得出WJ中這些改變的成纖維細胞來源于原始間充質組織的結論(Takechi等，1993)。隨后，Nanaev等(1997)更近一些的研究證實了在早產臍帶中增殖的間充質細胞祖細胞的五步分化。他們的發現支持了肌成纖維細胞存在于WJ基質中的提議。WJ細胞的免疫組織化學鑒定表明非常類似于已知是骨形態發生中成骨細胞主要來源的周細胞，并且還可以在培養物中形成稱為集落形成單位-成骨細胞(CFU-O)(Aubin，1998)的骨小結(bonenodules)(Canfield等，2000)。

近來有出版物報道了從UC而非UC血中收獲細胞的方法。Mitchell等(Mitchell等，2003)描述了一種方法，其中他們首次取出并棄去臍血管以收獲殘留的組織。然后將包括殘留的WJ(由于臍血管完整地包裹在WJ中，因此WJ中的一部分已與血管一起丟棄)和羊膜上皮的殘留的組織切塊以產生被轉移到組織培養皿中的小的組織碎片。接著將這些組織碎片用作為細胞從中遷移到培養基上的原始外植體。

在另一篇出版物中，Romanov等(2003)指出他們成功地從臍帶血管系統中分離了間充質干細胞樣細胞，盡管他們還指出他們的培養物不含有來自WJ的細胞。具體來說，自臍靜脈內部他們使用了單次15分鐘的膠原酶消化，其產生了混合的一群血管內皮和內皮下細胞。Romanov等表明在7天后少量成纖維細胞樣細胞出現在該細胞收獲物中。