[發(fā)明專利]β-糖苷酶突變體及其編碼基因與其在生產(chǎn)人參皂苷CK中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210460365.3
• 申請日: 2012-11-15
• 公開（公告）號: CN103805581A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁朝寧;唐雙焱
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12P33/20;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種β-糖苷酶突變體及其編碼基因與其在生產(chǎn)人參皂苷CK中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

人參是傳統(tǒng)的中醫(yī)藥材。據(jù)現(xiàn)代藥理研究報道，人參具有增強(qiáng)人體免疫力，改善營養(yǎng)、抗衰老和減緩疲勞等功效。人參皂苷CK作為人參的主要有效活性成分之一，更易于被人體吸收，且具有促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞衰亡、遏制腫瘤擴(kuò)散或惡化等醫(yī)療功效，因此具有極高的生產(chǎn)價值和應(yīng)用前景。然而，人參皂苷CK在天然的人參提取物中并不存在，而是由其它人參皂苷成分（如人參皂苷Rb₁,Rb₂,Rd,Re和Rg₁等）經(jīng)由腸道菌代謝轉(zhuǎn)化生成，因此在自然界中含量非常低。人參皂苷的轉(zhuǎn)化過程主要包括將葡萄糖等單糖基團(tuán)從主體結(jié)構(gòu)水解除去，水解的方法有化學(xué)水解法和生物催化反應(yīng)法等?；瘜W(xué)方法雖然轉(zhuǎn)化效率較高，但催化缺乏專一性，從而限制了其廣泛的應(yīng)用。而生物催化反應(yīng)法，利用酶法實現(xiàn)人參皂苷CK合成的研究比較少，主要是真菌來源的一些酶蛋白的純化和性質(zhì)研究，如純化自Paecilomyces?Bainier的葡糖苷酶，純化自Thermuscaldophilus的葡糖苷酶等被發(fā)現(xiàn)有合成人參皂苷CK的活性，但一方面活性較低、轉(zhuǎn)化過程中有中間產(chǎn)物累積；另一方面這些酶的基因序列均無報道，無法實現(xiàn)重組表達(dá)。在酶法合成人參皂苷CK的研究當(dāng)中，不僅轉(zhuǎn)化效率有待提高，而且同時應(yīng)盡量減少甚至消除中間產(chǎn)物的累積，以最大程度加大人參皂苷CK的產(chǎn)量，降低下游分離純化工作的難度。

來自硫磺礦硫化葉菌的β-糖苷酶（LacS，β-Glycosidase）已被報道具有合成人參皂苷CK的能力，但轉(zhuǎn)化效率有限，無法滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。利用該酶合成CK的優(yōu)勢在于：1、該酶已被重組表達(dá)，適于通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)一步提高其催化效率；2、該酶的反應(yīng)溫度較高，熱穩(wěn)定性非常好，有助于在高溫生產(chǎn)條件下完成產(chǎn)物合成，提高轉(zhuǎn)化效率，降低生產(chǎn)過程中污染的可能；3、該酶催化合成人參皂苷CK的中間過程已被清楚闡釋；4、該酶的晶體結(jié)構(gòu)已被報道，為其進(jìn)一步改造以及對酶突變體的分析提供了重要的參考信息。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種β-糖苷酶突變體及其編碼基因。

本發(fā)明提供的蛋白，命名為lacS-mut，是如下1）的蛋白質(zhì)：

1）由序列表中的序列4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；

2）將序列表中的序列4氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-糖苷酶活性的由1）衍生的蛋白質(zhì)。

上述序列表中的序列4由489個氨基酸組成，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述基因是如下(1）或(2）或(3）的DNA分子：

(1）序列表中序列3所示的DNA分子；

(2）在嚴(yán)格條件下與（1）限定的DNA序列雜交且編碼具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子；

(3）與（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件為在6×SSC，0.5%?SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC,0.1%?SDS和1×SSC,0.1%?SDS各洗膜一次。

上述序列3均由1470個核苷酸組成，所述序列3的編碼區(qū)為自5’末端第1-1470位核苷酸。

含有上述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體，具體為將序列表中的序列3所示的DNA分子插入載體pET28a的NheI和XhoI識別位點間得到的重組載體。

上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在作為β-糖苷酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述蛋白在生產(chǎn)人參皂苷CK中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)人參皂苷CK的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：