[發明專利]測量樣本中激發態壽命的方法

有效

• 申請號: 201210459090.1
• 申請日: 2012-11-14
• 公開（公告）號: CN103105383B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: B·威茲高斯蓋
• 申請（專利權）人: 徠卡顯微系統復合顯微鏡有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/00
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 王勇;王博

本發明公開了一種測量樣本中激發態壽命的方法，特別是測量熒光壽命的方法，以及執行這種方法的設備。首先，生成激發脈沖并用該激發脈沖照亮樣本區域。隨后，生成表示激發脈沖的功率?時間曲線的第一數字數據序列，并且根據第一數字數據序列確定第一開關時刻。此外，利用檢測器檢測從樣本區域發出的檢測光，生成表示檢測光的功率?時間曲線的第二數字數據序列，并且根據第二數字數據序列確定第二開關時刻。最后，計算第一和第二開關時刻之間的時間差。

技術領域

本發明涉及測量樣本中激發態壽命的方法，具體地，涉及測量熒光壽命的方法以及用于實施這種方法的設備。

本發明還涉及測量樣本中激發態壽命的設備，具體地，涉及測量熒光壽命的設備，該設備包括用于產生激發脈沖以利用該激發脈沖照亮樣本區域的光源以及用于檢測從樣本區域發出的檢測光的檢測器。

背景技術

通過分析利用一種或多種熒光染料標記的樣本的激發態壽命，可獲得與樣本性質有關的重要信息。尤其是當使用多種熒光染料時，可以通過利用熒光壽命成像顯微儀（FLIM）獲得與被分析的樣本區域有關的信息（例如與其成分和環境有關的信息）。在細胞生物學中，例如，可以通過測量熒光染料的壽命間接地推斷出樣本區域中的鈣離子濃度。

現有多種方法來測量熒光染料的激發態壽命。一些方法在1999年KluwerAcademic/Plenum出版的由Joseph R.Lakowicz所著的教科書“Principles ofFluorescence Spectroscopy”第二版中有所描述。例如，可以調制激發光隨著時間的功率，從而可以通過發出光的相位延遲推斷出激發態的壽命。

還可以利用短光脈沖激發熒光染料，從而可以電子地測量發射脈沖的時間延遲。舉例來說，德國專利公開文獻DE 102004017956A1描述了一種分析樣本中激發態的壽命的顯微鏡，其包括至少一個用于產生激發光的光源以及至少一個用于接收從樣本發出的檢測光的檢測器。顯微鏡的特征在于：光源包括發出脈沖激發光的半導體激光器以及調整設備，調整設備用于將脈沖重復頻率調整至樣本的特定的壽命特性。

具體地，數據分析所需的電子設備是可商購的，其通常以PC插卡的形式提供。然而，除了高成本之外，這樣的時間測量卡具有死區時間特別長的缺點，從而，在樣本激發之后，其僅能夠檢測第一個檢測脈沖（第一個檢測光子）的到達然后在很長的一段時間內處于“盲”狀態。最終，對于用戶來說，包含在從樣本發出的檢測光中的信息的很大一部分仍然是隱藏的。

此外，不可能對激發脈沖實現高重復頻率，因此，也不可能在一個測量周期內進行頻繁地測量。實際可實現的測量率遠低于可商購的脈沖激光器的一般重復頻率。出于該原因，舉例來說，需要十分長的時間才能收集足夠的數據以生成FLIM影像。

發明內容

因此，本發明的一個目的在于提供一種可能在較短的時間內獲得更精確測量結果的方法。

該目的是通過包括下述步驟的方法來實現的：

a.生成激發脈沖并用該激發脈沖照亮樣本區域，

b.生成表示激發脈沖的功率-時間曲線的第一數字數據序列，

c.根據第一數字數據序列確定第一開關時刻，

d.利用檢測器檢測從樣本區域發出的檢測光，

e.生成表示檢測光的功率-時間曲線的第二數字數據序列，

f.根據第二數字數據序列確定第二開關時刻，及

g.計算第一和第二開關時刻之間的時間差。

本發明的另一目的是提供一種可能在較短的時間內獲得更精確測量結果的設備。

該目的是通過上述類型的設備來實現的，該設備包括控制裝置，該控制裝置：