[發(fā)明專利]微生物菌群結(jié)構(gòu)的快速定性與定量方法及其在中國(guó)白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210455542.9
• 申請(qǐng)日: 2012-11-14
• 公開（公告）號(hào): CN102911998A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐巖;吳群
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于微生物在特殊鑒別培養(yǎng)基上的特殊菌落形態(tài)來(lái)對(duì)微生物菌群結(jié)構(gòu)的快速定性與定量方法，以及利用該方法在各種釀造食品中分析微生物菌群結(jié)構(gòu)及其演變規(guī)律的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

白酒行業(yè)是我國(guó)優(yōu)勢(shì)民族傳統(tǒng)的制造業(yè)，是食品工業(yè)的重要組成部分。2011年白酒制造業(yè)產(chǎn)量達(dá)1025.55萬(wàn)千升，工業(yè)產(chǎn)值3831.27億元，比2010年同比增長(zhǎng)41.40％。因此白酒行業(yè)的發(fā)展對(duì)于我國(guó)食品行業(yè)甚至國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展都具有重要的意義。然而，我國(guó)白酒制造業(yè)由于釀造機(jī)理缺乏，在釀造工業(yè)技術(shù)水平上卻與國(guó)際蒸餾酒和釀造酒工業(yè)存在著明顯的差距。因此，只有科學(xué)地認(rèn)識(shí)白酒釀造的生物學(xué)過(guò)程，才能對(duì)其進(jìn)行現(xiàn)代化改造，提高我國(guó)白酒生產(chǎn)技術(shù)水平。

白酒釀造微生物是白酒釀造的關(guān)鍵因素。因此，認(rèn)識(shí)白酒釀造微生物的發(fā)酵過(guò)程是認(rèn)識(shí)白酒釀造機(jī)制的重要基礎(chǔ)。但是中國(guó)白酒屬于復(fù)雜的多微生物自然釀造過(guò)程，是多種微生物共同作用的結(jié)果，包括酵母、細(xì)菌和霉菌等。因此，認(rèn)識(shí)釀造微生物菌群結(jié)構(gòu)是解析白酒釀造機(jī)制的關(guān)鍵。

目前，對(duì)于微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究，已經(jīng)從以前的傳統(tǒng)分離技術(shù)轉(zhuǎn)向未培養(yǎng)技術(shù)分析，并取得了一定的進(jìn)展。但是我國(guó)白酒釀造微生物的研究發(fā)展比較緩慢，上述兩種分離技術(shù)仍存在著自身的缺陷：對(duì)于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，只能對(duì)微生物總量進(jìn)行分析，無(wú)法明確各類微生物的數(shù)量及其變化；對(duì)于未培養(yǎng)手段，也存在一定的問(wèn)題，例如較難區(qū)分活菌和死菌，無(wú)法同時(shí)對(duì)微生物種屬進(jìn)行定性與定量，而且該技術(shù)儀器要求高，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)資。由于上述固有的缺陷，對(duì)釀造微生物菌群結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)仍然較為片面，無(wú)法系統(tǒng)、全面的認(rèn)識(shí)整個(gè)微生物菌群的發(fā)酵特征。

本發(fā)明公開了一種針對(duì)中國(guó)白酒群體微生物發(fā)酵特征的微生物菌群快速同時(shí)定性與定量方法，該技術(shù)基于微生物菌落形態(tài)特征與種屬的對(duì)應(yīng)關(guān)系，能夠經(jīng)濟(jì)、快速的對(duì)白酒釀造過(guò)程中各種細(xì)菌、酵母及霉菌的發(fā)酵特征進(jìn)行同時(shí)定性與定量分析。基于該技術(shù)，可對(duì)白酒釀造過(guò)程微生物菌群結(jié)構(gòu)及其演變規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)的解析，為進(jìn)一步對(duì)醬香型白酒功能微生物的開發(fā)與應(yīng)用，以及提升白酒的品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

要解決的技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題建立了復(fù)雜的微生物群體發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群體演變規(guī)律解析的快速定性與定量分析技術(shù)。本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了白酒釀造過(guò)程中復(fù)雜微生物菌群結(jié)構(gòu)及其演變規(guī)律分析的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案

微生物菌群結(jié)構(gòu)的快速定性與定量方法及其在中國(guó)白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，其對(duì)混合微生物發(fā)酵系統(tǒng)中酵母、細(xì)菌、霉菌的菌群結(jié)構(gòu)及其演變規(guī)律進(jìn)行定性與定量的分析。

分析微生物菌群結(jié)構(gòu)的方法：

所述分析的微生物菌群結(jié)構(gòu)為多微生物發(fā)酵系統(tǒng)的菌落結(jié)構(gòu)，將樣品與無(wú)菌水混合后，樣品為大曲、小曲、酒醅、環(huán)境或其它發(fā)酵原料。稀釋涂布鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)：

（a）酵母鑒別培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖：20～80；酵母膏：5～10；蛋白胨：5～10；氯化鉀：0.1～0.5；氯化錳：0.001～0.01；氯化鈣：0.1～0.5；硫酸鎂：0.1～0.5；硫酸鐵：0.001～0.01；硫酸銅：0.02～0.05；百里酚藍(lán)：0.01～1；溴甲酚綠：0.01～1；瓊脂：15～20；4～30℃培養(yǎng)2～6天；

（b）細(xì)菌鑒別培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏：5～10；酵母膏：10～20；蛋白胨：10～30；氯化鈉：5～10；硫酸鐵：0.001～0.01；氯化錳：0.001～0.01；瓊脂：15～20；溴甲酚紫：0.01～0.5；25～37℃培養(yǎng)1～3天；

（c）霉菌鑒別培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏：5～10；蛋白胨：5～10；葡萄糖10～50；硫酸鎂：0.5～1.0；硫酸錳：0.001～0.01；孟加拉紅：0.01～0.5；溴酚紅：0.01～0.5；氯霉素：0.01～0.5；瓊脂：15～20；25～35℃培養(yǎng)2～5天。

分析微生物菌群結(jié)構(gòu)的方法，包括如下鑒別步驟：

（1）建立酵母、細(xì)菌、霉菌三類微生物的種屬與其在鑒別培養(yǎng)基上的特殊菌落形態(tài)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

微生物種屬鑒別方法如下：對(duì)鑒別培養(yǎng)基上具有不同菌落形態(tài)的微生物，采用分子方法對(duì)酵母、細(xì)菌、霉菌三類微生物進(jìn)行種屬鑒定，其中，對(duì)酵母26srDNA序列，細(xì)菌16srDNA序列，霉菌18srDNA序列進(jìn)行測(cè)序并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，建立鑒定微生物的種屬的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

（2）通過(guò)微生物在鑒別培養(yǎng)基上的形態(tài)來(lái)鑒別微生物的種屬；