[發明專利]一種以葡萄糖為底物合成生松素的大腸桿菌工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201210454163.8
• 申請日: 2012-11-14
• 公開（公告）號: CN102936577A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 陳堅;周景文;吳俊俊;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛

技術領域

本發明涉及一種產生松素的大腸桿菌工程菌，是一種通過合成生物學和代謝工程手段過量表達由aroF、pheA^fbr、PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC等八個基因組成的合成途徑，實現以葡萄糖為底物來生產生松素的大腸桿菌工程菌。

背景技術

黃酮類化合物(flavonoids)是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結構的化合物，其羥基衍生物多具黃色，因而得名。黃酮類化合物具有多種生物活性，主要包括心血管系統、抗菌及抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎等，對鎮痛、保肝、抗突變、降血糖和止咳平喘等具有預防、治療或輔助治療效果，而且人體不能合成黃酮類化合物，只能從植物性食物中獲得，因此近年來，黃酮類化合物的市場每年增長30％以上，在藥品和營養化學品領域上具有廣闊的應用前景。

黃酮類化合物分布廣泛，種類繁多，黃酮類化合物主要包括黃酮類(如黃岑素、黃岑苷等)、黃酮醇類(如槲皮素、生松素等)、二氫黃酮類(如陳皮素、甘草苷等)、二氫黃酮醇類(如水飛薊素、異水飛薊素等)、異黃酮類(如大豆素、葛根素等)、二氫異黃酮類(如魚藤酮等)、查爾酮類(如異甘草素、補骨脂乙素等)、橙酮類(如金魚草素等)、黃烷類(如兒茶素等)、花色素類(如飛燕草素、矢車菊素等)和雙黃酮類(如銀杏素、異銀杏素等)。而其中生松素是一種很重要的黃酮骨架物質，人們可以通過對生松素進行羥基化、還原化、烷基化、氧化等修飾而獲得良姜素、黃烷酮醇、白楊黃素等眾多黃酮物質，另外生松素本身作為一種黃酮物質具有多種生物活性，主要包括緩解神經痛，防止腦水腫的發生，減少腦缺血的發生幾率等。

目前，工業上生產生松素主要采用植物提取和化學合成等方法，但是如何從植物復雜的提取液中得到所需要的高純度黃酮仍然是人類無法解決的一個技術難題，而高污染、使用有毒和有害化學試劑、以及黃酮物質的復雜結構等因素限制了化學法的使用，正因如此，微生物發酵法以使用廉價無污染的原料、較低的污染的排放、較低的能源需求等優點受到越來越多的關注。目前國內外關于微生物發酵法生產生松素的研究都需要在發酵液添加價格昂貴的前體物質如苯丙氨酸或者肉桂酸，而且從食品安全角度來考慮，由于肉桂酸是從脫胎于石油工業的化學合成法合成而來，因此肉桂酸的添加尤其得不到商業上的應用。另外目前的發酵法都采用的是兩步法生產，即菌株首先在營養豐富的培養基中生長，在達到一定菌濃的時候，通過離心等方法收集所有的菌體置于基本培養基中發酵，顯然這種發酵方式無法應用于大規模工業化。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種以葡萄糖為底物直接合成生松素的基因工程菌株，無需添加貴重的前體物質，只在單一培養基中便能合成生松素的大腸桿菌工程菌，通過在菌株體內構建從葡萄糖到生松素的由aroF、pheA^fbr、PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC等八基因構成的合成途徑，實現以葡萄糖為底物來合成黃酮骨架物質生松素。

以下是本發明技術方案的詳細描述。

途徑基因的選擇

以葡萄糖為底物的L-Phe生物合成途徑由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤蘚糖(E4P)在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP?synthases，DS)的催化下縮合生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反應為第一個限速反應。第二和第三個限速反應分別為由分支酸在分支酸變位酶(Chorismate?mutase，CM)的作用下轉變為預苯酸，繼而在預苯酸脫水酶(Prephenate?dehydratase，PDT)的作用下脫水、脫羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因編碼的雙功能酶。因此過量表達pheA和aroF這兩個基因。