[發明專利]一種以葡萄糖為底物合成生松素的大腸桿菌工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201210454163.8
• 申請日: 2012-11-14
• 公開（公告）號: CN102936577A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 陳堅;周景文;吳俊俊;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛

1.一種以葡萄糖為底物合成生松素的大腸桿菌工程菌，其特征在于表達生松素合成途徑中的需要的關鍵酶系，所述酶系為3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶，分支酸變位酶，預苯酸脫水酶，苯丙氨酸脫氨酶，4-香桂酸：輔酶A連接酶，查爾酮合成酶，查爾酮異構酶，丙二酸轉運酶以及丙二酸吸收酶。

2.權利要求1所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因核苷酸序列如Genbank：NC000913.2所示，所述分支酸變位酶和預苯酸脫水酶的基因核苷酸序列如Genbank：GQ303716，所述丙二酸轉運的基因核苷酸序列如Genbank：AAC83455，所述丙二酸吸收酶的基因核苷酸序列如Genbank：AAC83457，所述苯丙氨酸脫氨酶的基因核苷酸序列如Genbank：DQ013364，所述4-香桂酸：輔酶A連接酶的基因核苷酸序列如Genbank：X13325，所述查爾酮合成酶的基因核苷酸序列如Genbank：AF233638，所述查爾酮異構酶的基因核苷酸序列如Genbank：M91079。

3.權利要求1或2所述工程菌的構建方法，其特征在于根據Genbank：NC000913.2，GQ303716，AAC83455，AAC83457，DQ013364，X13325，AF233638，M91079，分別采用化學全合成方法獲得途徑所需要的基因，克隆到表達載體后分別轉化大腸桿菌Escherichia?coli(BL21)后得到所述基因工程菌。

4.權利要求1所述工程菌應用于生松素的生產，其特征在于以權利要求1所述工程菌為出發菌株，接種到MOPS培養基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37℃、250rpm條件下培養12-20h至菌株OD₆₀₀達到1.0-2.0；然后加入25ml相同的MOPS培養基，加入IPTG、調節濃度為1mM，30℃，250rpm條件下繼續培養60h。

5.根據權利要求書4所述的方法，其特征在于MOPS培養基組成為(g/L)：葡萄糖5g，氯化銨4g，磷酸氫二鉀0.3g，丙二酸2g，MOPS83.7g，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668g，氯化銨5.1g，硫酸鐵0.03g，硫酸鉀0.5g，氯化鎂1.1g，氯化鈉29.2g，微量元素10ml，自來水定容至1L。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述微量元素采用ATCC?BAA-2326的配方。