[發(fā)明專利]高產(chǎn)安絲菌素發(fā)酵工藝

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210453649.X
• 申請(qǐng)日: 2012-11-13
• 公開（公告）號(hào): CN103805648B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董清風(fēng);譚炳華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 百奧泰生物科技（廣州）有限公司
• 主分類號(hào): C12P17/18
• 分類號(hào): C12P17/18;C07D498/18;C12R1/01
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11285
• 代理人: 張廣育,姜建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生產(chǎn)安絲菌素的培養(yǎng)基及一種新型安絲菌素發(fā)酵工藝和精制方法，屬于生物工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

1972年S.M.庫普錢等從非洲收集的卵葉美登木中(含量為千萬分之二)首先分離得到美登素，其母核為19-C的大環(huán)內(nèi)酰胺或Ⅰ型多聚酮類，后來發(fā)現(xiàn)珍貴橙色束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum）也能產(chǎn)生與其類似的多種產(chǎn)物，將之稱為美登素類抗生素，在限定的培養(yǎng)條件下，安絲菌素P-3（AP-3）是其主要成分。因它對(duì)各種腫瘤，如L-1210、P-388白血病、S-180、W-256、路易斯肺癌和體外鼻咽癌均有顯著療效，從而具有巨大的應(yīng)用前景，例如目前AP-3作為免疫毒素結(jié)合劑的方式治療惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)已進(jìn)入最后階段。因此，未來市場(chǎng)對(duì)AP-3的需求將是大量的，從而高效大規(guī)模生產(chǎn)AP-3已成為研究熱點(diǎn)之一。

高效大規(guī)模生產(chǎn)AP-3，主要從三個(gè)方面入手。一是獲得AP-3高產(chǎn)菌株，二是得到利于高產(chǎn)菌株生長和代謝的培養(yǎng)基，三是探索應(yīng)用適合的發(fā)酵工藝。目前報(bào)道的AP-3高產(chǎn)菌株通過基因改造和誘變的手段獲得。Bandi等（J.Microbiol.biotechnol.（2006）,16（9）,1338~1346）通過將出發(fā)菌株ATCC 31565的asm2（AP-3生成相關(guān)基因)刪除，AP-3含量由0.53 mg/L提高到5.0 mg/L，之后通過響應(yīng)曲面方法優(yōu)化其培養(yǎng)基組成，AP-3含量提高到78.3 mg/L。Daniel等（J Ind Microbiol Biotechnol(2009 36:1345~1351)）分別將asm2和asm39上調(diào)表達(dá)，使得AP-3含量分別提高到33 mg/L和52 mg/L。辛西亞·郭等通過將菌株ATCC31565經(jīng)紫外和化學(xué)試劑兩輪誘變，獲得變異菌株Actinosynnema pretiosum PF4-4，在其限定的培養(yǎng)基和補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝下，900 L/1500 L發(fā)酵罐水平AP-3含量達(dá)到304mg/L（專利CN 101103120A，WO 03/064610 A2）。這也是目前報(bào)道的AP-3最高發(fā)酵水平和最大發(fā)酵規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種安絲菌素高效發(fā)酵工藝，其特征在于，首先進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，隨后轉(zhuǎn)換為重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵。在一個(gè)實(shí)施方案中，在補(bǔ)料分批發(fā)酵階段，使用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵一段時(shí)間后，向發(fā)酵液中加入異丁醇，繼續(xù)發(fā)酵一段時(shí)間后，向發(fā)酵液中流加葡萄糖；繼續(xù)發(fā)酵一段時(shí)間后，進(jìn)入重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵階段，放掉發(fā)酵液的一部分，補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基并向發(fā)酵液中加入異丁醇，一段時(shí)間后，向發(fā)酵液中流加葡萄糖。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述發(fā)酵工藝的補(bǔ)料分批發(fā)酵階段，使用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵2~3天后，向發(fā)酵液中加入0.10~0.30%(v/v)的異丁醇，發(fā)酵進(jìn)行4~6天后，向發(fā)酵液中流加葡萄糖，流加速率為3~10 g/L/d；發(fā)酵進(jìn)行8~12天后，進(jìn)入重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵階段，放掉發(fā)酵液的30~50%，補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基并向發(fā)酵液中加入0.10~0.30%(v/v)的異丁醇，在重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵階段開始2~4天后，向發(fā)酵液中流加葡萄糖，流加速率為3~10 g/L/d，重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵階段持續(xù)時(shí)間為7~10天。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵工藝參數(shù)為，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的0.3%~10.0%（v/v），溫度25~30℃，pH 6.8~7.6，DO（溶氧）20%~60%，壓力0.03~0.08 MPa，通氣量0.1~0.6 VVM（air volume/culture volume/min，通氣比），攪拌速度100~300 rpm。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述發(fā)酵工藝參數(shù)為，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的6.0%（v/v），溫度28℃，pH 7.3，DO 40%，壓力0.05 MPa，通氣量0.4 VVM，攪拌速度160 rpm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵工藝中pH的控制是通過自動(dòng)流加NH₃·H₂O和30%醋酸來實(shí)現(xiàn)的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵工藝使用的菌種為珍貴橙色束絲放線菌ATCC 31565。發(fā)酵種子為利用發(fā)酵培養(yǎng)基，從珍貴橙色束絲放線菌的平板上挑取單菌落，在28℃260 rpm搖床培養(yǎng)4~6天獲得的。