[發明專利]用于發酵生產L-賴氨酸的重組DNA、菌株及其應用

有效

• 申請號: 201210450748.2
• 申請日: 2012-11-12
• 公開（公告）號: CN103215286A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 張偉國;宋燦輝;錢和
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/63;C12N1/21;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州慧通知識產權代理事務所(普通合伙) 32239
• 代理人: 丁秀華

技術領域

本發明涉及L-賴氨酸的生產方法，特別涉及一種用于發酵生產L-賴氨酸的DNA、菌株及方法，屬于微生物工程技術領域。

背景技術

發酵法生產L-賴氨酸，大多采用從自然環境分離的微生物菌株并由此微生物菌株得到的人工突變株。已知的高產人工突變株大多為S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、磺胺胍(SG)、賴氨酸乙酯鹽酸鹽(Lys-OEt)等抗性，且多為高絲氨酸缺陷型或蘇氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型，并且屬于埃希氏屬、棒桿菌屬，短桿菌屬。

就埃希氏屬來說，根據專利公開號CN?1423691A披露了通過增強來源于大腸桿菌脫敏的天冬氨酸激酶III、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脫酰酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和天冬氨酸-β-半醛脫氫酶來增加L-賴氨酸的產量。

就棒桿菌和短桿菌屬來說，根據專利公開號CN?100451104C中的報道，通過增強丙酮酸羧化酶、二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、L-賴氨酸輸送蛋白和二氫吡啶二羧酸還原酶來增加L-賴氨酸的產量。

在大腸桿菌中，L-賴氨酸合成以草酰乙酸為前體，通過過量表達來源于大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，將磷酸烯醇式丙酮酸直接羧化為草酰乙酸，增加了L-賴氨酸合成的前體；通過過量表達來源于大腸桿菌的脫敏的天冬氨酸激酶III和天冬氨酸-β-半醛脫氫酶來增加天冬氨酸代謝途徑的代謝通量；通過過量表達來源于大腸桿菌的脫敏的二氫吡啶二羧酸合酶和來源于棒桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶來增加L-賴氨酸合成的代謝流量。

但是，上述用于增強表達大腸桿菌中L-賴氨酸合成途徑關鍵酶的質粒都需要在表達的基因前面加入啟動子，例如專利CN?1423691A所述的pCABDE1過量表達了lysC、dapA、dapB、ddh、dapE這5個基因，其中dapA受Ptet啟動子的控制，lysC、dapB、ddh和dapE分別受4個Plac啟動子的控制。

發明內容

本發明的目的之一是克隆L-賴氨酸產生菌L-賴氨酸生物合成途徑關鍵酶的基因，并解析其序列。

本發明的另一目的是獲得對L-賴氨酸脫敏的天冬氨酸激酶III和二氨基庚二酸合酶。

本發明的又一目的是表達L-賴氨酸生物合成途徑的酶的基因，提高L-賴氨酸的產量。

此外，本發明的目的還包括提供一種大腸桿菌菌株，其中如下L-賴氨酸生物合成途徑的酶的活性得到增強：

①lysC基因編碼的天冬氨酸激酶III；

②dapA基因編碼的二氨基庚二酸合酶；

③ppc基因編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；

④asd基因編碼的天冬氨酸-β-半醛脫氫酶；

⑤ddh基因編碼的二氨基庚二酸脫氫酶。

本發明的目的還包括提供一種發酵L-賴氨酸的方法。

為實現上述發明目的，本發明采用了如下技術方案：

一種用于發酵生產L-賴氨酸的重組DNA，包括解除了L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶反饋抑制的編碼天冬氨酸激酶III和二氫吡啶二羧酸合酶的DNA序列、編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的DNA序列、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA序列以及編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。

具體而言，所述解除了L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III的反饋抑制的天冬氨酸激酶III從N端開始計算，該天冬氨酸激酶III催化亞基的第318位氨基酸由蛋氨酸變為異亮氨酸；第323位氨基酸由甘氨酸變為天冬氨酸，其序列見SEQ?ID?NO：14，且該二氫吡啶二羧酸合酶調節亞基的第118位氨基酸由組氨酸變為酪氨酸，其序列見SEQ?ID?NO：15。

所述天冬氨酸-β-半醛脫氫酶是來源于大腸桿菌的編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶，其包含與SEQ?ID?NO：16實質相同的氨基酸序列。

所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是來源于大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其包含與SEQ?ID?NO：18實質相同的氨基酸序列。

所述二氨基庚二酸脫氫酶是來源于棒狀桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶，其包含與SEQ?ID?NO：17實質相同的氨基酸序列。

包含如上所述重組DNA的表達質粒pWG-aACPD。

一種大腸桿菌，包含如上所述的重組DNA。

一種大腸桿菌，是導入如上所述的重組DNA或表達質粒pWG-aACPD而轉化過的。

如上所述大腸桿菌在發酵生產L-賴氨酸工藝中的應用。