[發(fā)明專利]一種從獼猴桃葉片中提取RNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210449428.5
• 申請(qǐng)日: 2012-11-12
• 公開（公告）號(hào): CN102899319A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田宏現(xiàn);彭司英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉首大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種RNA的提取方法，具體指從獼猴桃葉片中提取RNA的新方法。

背景技術(shù)

獼猴桃葉片中總RNA提取質(zhì)量的好壞是獼猴桃轉(zhuǎn)基因育種反轉(zhuǎn)錄合成cDNA成敗的關(guān)鍵之一，通過提取獼猴桃葉片中的RNA并結(jié)合其它生物技術(shù)可獲得各種特性的轉(zhuǎn)基因獼猴桃新品種，使得獼猴桃葉片中RNA的提取具有重要應(yīng)用價(jià)值。

獼猴桃葉片中可溶性多糖、多酚的含量較高，而多糖、多酚的許多理化性質(zhì)和?RNA?相似，易與RNA?形成難溶的膠狀物共沉淀，造成RNA?產(chǎn)量減少，或者多糖、多酚溶解后形成黏稠的溶液污染?RNA?樣品，造成RNA?質(zhì)量降低，從而影響轉(zhuǎn)基因獼猴桃的育種。

現(xiàn)有技術(shù)中，Trizol法是大部分植物RNA提取的通用方法，但不適合用于獼猴桃等多糖多酚類植物RNA的提取，用Trizol法提取獼猴桃葉片中RNA時(shí)，樣品在Trizol緩沖液中很快褐化，在用氯仿抽提時(shí)上清液成膠狀，多糖多酚的影響非常嚴(yán)重，RNA很難分離，造成RNA?純度低、品質(zhì)差。

因此，開發(fā)獼猴桃葉片中RNA的提取新方法，保證猴桃葉片中RNA提取的完整、高純度和較高的提取率具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為解決獼猴桃葉片中RNA提取的技術(shù)問題，本發(fā)明人通過大量試驗(yàn)，終于發(fā)明出一種從獼猴桃葉片中提取RNA的新方法，運(yùn)用該方法，能保證猴桃葉片中RNA提取的完整、高純度和較高的提取率。

本發(fā)明包括以下幾個(gè)步驟：

（1）獼猴桃葉片的前處理。將剛摘取的獼猴桃葉片剪碎后，立即投入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％－4％的異硫氰酸胍的50％－80％的乙醇溶液中，獼猴桃葉片與溶液的質(zhì)量體積比為1：50－1：200（質(zhì)量的單位為克，體積的單位為毫升），常溫下浸提1－3小時(shí)。

（2）獼猴桃總RNA的提取。將RNA提取緩沖液于55－75℃水浴鍋中溫育30?-40分鐘，立即取上述處理的葉片加緩沖液于研缽中快速研磨（葉片與緩沖液的質(zhì)量體積比為1：10－1：30，質(zhì)量的單位為克、體積的單位為毫升，研磨過程中加液氮以防止RNA降解）。把研磨好的，成粘稠狀的勻漿液移入離心管中，55－75℃溫育5－15?分鐘，加入等體積的氯仿和異戊醇的混合溶液（氯仿和異戊醇的體積比為20?:?1－30：1），上下劇烈震蕩10-90秒，然后于0－20℃，5000－20000?g，離心5－60分鐘。取上清，重復(fù)上述抽提步驟2-4次。取上清，加入上清液1/5－1/2體積的5－15M?LiCl溶液并混勻，-10℃－-50℃條件下放置10-20?小時(shí)，使RNA沉淀。0－20℃，5000－20000?g，離心5－60分鐘，棄上清，獲粗提的總RNA沉淀。

RNA提取緩沖液是一種水溶液，這種溶液中CTAB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,、PVP40的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%-5%、Tris-Cl?的濃度為100?mM（pH?8.0）、EDTA的濃度?25?mM（pH?8.0），NaCl?的濃度為2?M，β-ME?的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-5%?(用時(shí)加入)。

（3）獼猴桃RNA的純化。加入DEPC處理過的水溶解上述得到的總RNA（水與總RNA的體積質(zhì)量比為5:1-20:1，體積的單位為ml，質(zhì)量的單位為g），再加入DEPC處理過的水1/30－1/3體積的1－10?M?NaAc，1－10體積的90?%－98％的乙醇。置于-5℃－-50℃，1-5小時(shí)，使RNA沉淀。0－20℃，5000－20000?g，離心5－60分鐘，棄上清，用50%－95％乙醇清洗沉淀，空氣中干燥后即得RNA。（得到的RNA可加入DEPC處理過的水溶解，保存于-70℃?zhèn)溆没蛑苯佑脽o水乙醇溶解保存）。

上述操作過程中，所有的器皿均經(jīng)過殺滅RNA酶活性處理，使提取的RNA不被破壞；所涉及的酒精濃度，指的是體積比。通過本發(fā)明得到的獼猴桃RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見兩條清晰的條帶，且兩條帶亮度比為1.8:1－2.2:1，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260nm和A280nm比值，比值在1.9-2.0?之間，是高品質(zhì)的RNA。

本發(fā)明的特點(diǎn)是以獼猴桃葉片為材料，用異硫氰酸胍酒精溶液先去除葉片中的多糖、多酚類雜質(zhì)，避免多糖、多酚類物質(zhì)對(duì)獼猴桃RNA提取的影響，使提取的獼猴桃RNA純度高、品質(zhì)好；用異硫氰酸胍酒精溶液去除葉片中多糖、多酚類雜質(zhì)的同時(shí)還保持了RNA的完整性。

?具體實(shí)施方式

以下對(duì)獼猴桃葉片中RNA的具體提取方法進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：