[發(fā)明專利]一種提取植物總蛋白的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210447423.9
• 申請(qǐng)日: 2012-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN102924566A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王紹輝;楊瑞;郝敬虹;邢佳毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K1/30
• 分類號(hào): C07K1/30;G01N1/28
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提取植物總蛋白的方法。

背景技術(shù)

樣品制備是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵因素，樣品制備的質(zhì)量幾乎直接決定下游分析的結(jié)果。理想的樣品制備方法應(yīng)當(dāng)可以最大限度的溶解全部蛋白質(zhì)，同時(shí)可以將蛋白質(zhì)降解、修飾與非蛋白質(zhì)類物質(zhì)污染降低到最小，并具備良好的重復(fù)性。

尤其是對(duì)于植物組織，其中不但富含大量細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，富含蛋白酶與氧化酶，而且還含有大量多糖和次生代謝產(chǎn)物（例如脂類、酚類、淀粉等），這些不利因素都導(dǎo)致難以獲得無(wú)污染、無(wú)修飾、完整高質(zhì)量的植物細(xì)胞蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種提取植物總蛋白的方法，特備是一種提取番茄植株韌皮部總蛋白的方法。

本發(fā)明提供的提取植物總蛋白的方法，包括如下步驟：

（1）取植物材料，加入PVPP和石英砂，用液氮研磨成粉末；

（2）取步驟（1）得到的粉末，加入蛋白質(zhì)提取緩沖液并振蕩勻漿，然后加入Tris飽和酚進(jìn)行提取，取有機(jī)相；

（3）取步驟（2）得到的有機(jī)相，與蛋白質(zhì)沉淀液混合后靜置，然后離心收集沉淀；

（4）取步驟（3）得到的沉淀，依次進(jìn)行甲醇清洗、丙酮清洗和冷凍干燥，得到植物總蛋白。

所述蛋白質(zhì)提取緩沖液的制備方法具體如下：將500mmol?Tris-HCl、50mmol?EDTA、700mmol蔗糖和100mmol?KCl溶于水并用水定容至1L，調(diào)pH至8.0，使用前加入β-巰基乙醇和各種蛋白酶，使得β-巰基乙醇的濃度為2%（體積百分含量）、糜蛋白酶的濃度為1.5μg·ml^-1、嗜熱菌蛋白酶的濃度為0.8g·ml^-1、木瓜蛋白酶的濃度為1μg?·ml、鏈霉蛋白酶的濃度為1.5μg·ml^-1、胰酶的濃度為15μg·ml^-1、胰蛋白酶的濃度為0.2μg·ml^-1。

所述蛋白質(zhì)沉淀液的制備方法具體如下：將乙酸銨溶于甲醇，并用甲醇定容，使得乙酸銨的濃度為0.1mol·L^-1。

所述植物材料具體可為番茄韌皮部。

每2g所述植物材料可加入0.2g?PVPP。

所述步驟（2）的具體步驟可為：取1g步驟（1）得到的粉末，加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL?Tris飽和酚并混勻，4℃放置30min（可間隔時(shí)間振蕩，以充分反應(yīng)），然后4℃、10000g離心15min，吸取有機(jī)相。

所述步驟（2）的具體步驟可為：取1g步驟（1）得到的粉末，加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL?Tris飽和酚并混勻，4℃放置30min（可間隔時(shí)間振蕩，以充分反應(yīng)），然后4℃、10000g離心15min，吸取出有機(jī)相后再加入3mL所述蛋白質(zhì)提取緩沖液并混勻，加入3mL?Tris飽和酚并混勻，4℃放置30min，然后4℃、10000g離心15min，吸取有機(jī)相。

所述步驟（3）的具體步驟可為：每管加入250μL步驟（2）得到的有機(jī)相和1mL所述蛋白質(zhì)沉淀液，漩渦混勻，-20℃靜置10小時(shí)。

所述甲醇清洗具體可進(jìn)行三次，每次的步驟為：每管得到的沉淀加入500μL?4℃預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻，4℃、10000g離心10min，棄掉上清液；所述丙酮清洗進(jìn)行三次，每次的步驟為：每管得到的沉淀加入500μL?4℃預(yù)冷的丙酮，漩渦混勻，4℃、10000g離心10min，棄掉上清液。

以上任一所述的番茄具體可為番茄品種CM(Lycopersicon?esculentum?L.cvCastlemart)。

本發(fā)明提供的提取植物總蛋白的方法是對(duì)現(xiàn)有的酚-甲醇法的改進(jìn)，主要改進(jìn)點(diǎn)在于：（1）在樣品研磨破碎過(guò)程中添加PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮）來(lái)吸附酚類物質(zhì)，，而不是常規(guī)使用的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PVP為可溶性物質(zhì)，易溶于酚-甲醇提取法的水相，難以去除，從而會(huì)干擾第一相等點(diǎn)聚焦電泳，而PVPP為不溶性物質(zhì)，在提取過(guò)程中吸附酚類物質(zhì)后可以通過(guò)離心去除，不會(huì)干擾下游分析過(guò)程；（2）當(dāng)植物細(xì)胞破碎的時(shí)候，細(xì)胞中的蛋白水解酶就會(huì)被釋放出來(lái)并被激活，使得各個(gè)蛋白組分被降解掉，導(dǎo)致電泳結(jié)果復(fù)雜化并影響最終的結(jié)果分析，針對(duì)此問(wèn)題，通過(guò)對(duì)蛋白水解酶的降解避免蛋白水解酶對(duì)各個(gè)蛋白組分的降解，將非正常的蛋白質(zhì)降解或修飾降到最低水平，最大限度的保持植物材料中的蛋白質(zhì)的活性與自然特性。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中的電泳圖。

圖2為對(duì)比例1中的電泳圖。