[發(fā)明專利]一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建及向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210444334.9
• 申請日: 2012-11-08
• 公開（公告）號(hào): CN102899288A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹暉;徐軍軍;孫振華
• 申請（專利權(quán)）人: 厚樸生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;C12N5/071;C12N5/079;C12N5/077;A61K35/39;A61P3/10
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285
• 代理人: 寧濤;張廣育

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系構(gòu)建及向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法。?

背景技術(shù)

糖尿病是繼心血管疾病和癌癥之后的第三大高發(fā)慢性疾病，它嚴(yán)重危害著人類的生命健康。目前，對糖尿病的治療雖然有很多方法，如口服降糖藥物，注射外源性胰島素，并結(jié)合飲食限制以及體育鍛煉的方法，但都不能從根本上解決問題。器官移植是一種比較好的解決方法，但該方法的應(yīng)用受到供體不足和免疫排斥問題的限制。而干細(xì)胞增殖力強(qiáng)、數(shù)量充足、移植排斥反應(yīng)相對較低。因此，人們寄希望于干細(xì)胞替代療法能夠解決供體不足和免疫排斥的問題。?

干細(xì)胞的使用雖然能夠解決供體細(xì)胞數(shù)量問題，但是在應(yīng)用前還需要先將其誘導(dǎo)分化為功能性的胰島素分泌細(xì)胞。胰腺干細(xì)胞(Pancreatic?stem?cells)是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細(xì)胞，具有自我更新，多向分化潛能，在自然分化過程中首先分化為胰腺組織內(nèi)的各種細(xì)胞。由于該細(xì)胞來源于胰腺組織，因此，在向胰島素分泌細(xì)胞分化方面具有更大的潛力。越來越多的證據(jù)表明胰腺導(dǎo)管、胰島和腺泡組織內(nèi)都存在著具有多向分化潛能的干細(xì)胞。目前有觀點(diǎn)認(rèn)為，由胰島組織獲得的間充質(zhì)樣干細(xì)胞可能來源于去分化后的β細(xì)胞(Russ，H.A.，Bar，Y.，Ravassard，P.，Efrat，S.2008?In?vitroproliferation?of?cells?derived?from?adult?human?beta-cells?revealed?bycell-lineage?tracing.Diabetes，57：1575～1583)。并且這些細(xì)胞在體外多次傳代后其胰島素啟動(dòng)子仍處于活化狀態(tài)，因此具有巨大的糖尿病治療潛力。?

體外分離、培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并將其定向誘導(dǎo)分化為功能性胰島細(xì)胞，是解決胰島供體短缺的有效途徑。已有多個(gè)研究小組在胰腺干細(xì)胞的研究上開展了一定的基礎(chǔ)工作。西北農(nóng)林科技大學(xué)效梅(單克隆人胰腺干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系的建立[J].分子細(xì)胞生物學(xué)，2008，41(6)：450-456.)、趙婷(人胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)胰島樣細(xì)胞團(tuán)及其治療大鼠糖尿病的效果[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(7)：1259-1262.)、第三軍醫(yī)大學(xué)姚忠祥(人胰腺干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)、鑒定和分化特性[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(1)：23-25.)吉林大學(xué)等先后在胰腺干細(xì)胞的分離純化，培養(yǎng)基的篩選，以及細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)鑒定方面做了大量的工作；分離到的胰腺干細(xì)胞在體內(nèi)定向誘導(dǎo)后形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，并檢測到胰島素和C-肽的分泌，但分化效率都很低，移植后對糖尿病的治療效果不顯著。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系體外構(gòu)建的方法，將該干細(xì)胞系體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞團(tuán)的方法，以及用上述方法得到的胰腺干細(xì)胞系和胰島樣細(xì)胞團(tuán)。將所述胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植至糖尿病模型動(dòng)物后能夠改善其血糖水平。?

本發(fā)明提供一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系體外構(gòu)建的方法，該方法包括如下步驟：消化人胰腺組織，挑出胰島細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)一步消化形成單細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)后形成間充質(zhì)樣胰腺干細(xì)胞。?

所述的胰腺干細(xì)胞系，其細(xì)胞為成纖維樣，多呈三角形和短梭狀，單核細(xì)胞，有兩個(gè)或兩個(gè)以上的核仁，細(xì)胞間存在接觸抑制。?

所述的胰腺干細(xì)胞系，經(jīng)誘導(dǎo)可分化形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)。?

本發(fā)明的第一方面提供一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：?

1)將人胰腺細(xì)胞加入培養(yǎng)液A中培養(yǎng)2-3天；?

2)挑出上述培養(yǎng)物中的胰島細(xì)胞團(tuán)，用蛋白酶消化成單細(xì)胞，接種于培養(yǎng)液A中培養(yǎng)；?

3)待細(xì)胞生長至80-90％融合時(shí)，傳代，加入培養(yǎng)液B培養(yǎng)，得?到胰島細(xì)胞來源的人胰腺干細(xì)胞系(hPSC)；?

其中所述培養(yǎng)液A為含有10-25％?FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mL?EGF和18-22ng/mL?bFGF的RPMI1640；所述培養(yǎng)液B為含有10-25％FBS、18-22ng/mLbFGF的Low-DMEM。?

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)液A還含有0.8-1.2mM丙酮酸鈉、1.8-2.2mM谷氨酰氨、0.05-0.15mM?β-巰基乙醇和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素；所述培養(yǎng)液B還含有0.05-0.15mM?β-巰基乙醇、1.8-2.2mM谷氨酰胺和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素。?

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述方法包括以下步驟：?