[發明專利]一種人胰島來源的胰腺干細胞系的構建及向胰島素分泌細胞分化的方法

有效

• 申請號: 201210444334.9
• 申請日: 2012-11-08
• 公開（公告）號: CN102899288A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 曹暉;徐軍軍;孫振華
• 申請（專利權）人: 厚樸生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071;C12N5/079;C12N5/077;A61K35/39;A61P3/10
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 寧濤;張廣育

1.一種人胰島來源的胰腺干細胞系的構建方法，該方法包括以下步驟：

1)將人胰腺細胞加入培養液A中培養2-3天；

2)挑出上述培養物中的胰島細胞團，用蛋白酶消化成單細胞，接種于培養液A中培養；

3)待細胞生長至80-90％融合時，傳代，加入培養液B培養，得到胰島細胞來源的人胰腺干細胞系(hPSC)；

其中所述培養液A為含有10-25％?FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mLEGF和18-22ng/mL?bFGF的RPMI1640；所述培養液B為含有10-25％FBS、18-22ng/mLbFGF的Low-DMEM。

2.權利要求1的方法，其中所述培養液A還含有0.8-1.2mM丙酮酸鈉、1.8-2.2mM谷氨酰氨、0.05-0.15mM?β-巰基乙醇和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素；所述培養液B還含有0.05-0.15mM?β-巰基乙醇、1.8-2.2mM谷氨酰胺和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素。

3.權利要求1或2的方法，該方法包括以下步驟：

1)向人胰腺的組織塊中加入0.05-0.2％(質量/體積)膠原酶消化，終止消化后過濾、離心并清洗得到單細胞，加入所述培養液A培養2-3天；

2)在顯微鏡下挑出胰島細胞團，0.25％(質量/體積)蛋白酶將其進一步消化成單細胞，接種于多孔板內，添加所述培養液A培養；

3)待細胞生長至80-90％融合時，以0.25％蛋白酶消化，以1∶3-1∶5比例傳代，加入所述培養液B進行培養；培養超過50代后得到胰島細胞來源的人胰腺干細胞系。

4.一種使人胰腺干細胞系體外誘導分化成胰島樣細胞團的方法，該方法包括以下步驟：

1)將人胰腺干細胞接種于含有0.8-1.2％?BSA、0.8-1.2mM丁酸鈉、80-120ng/mL?ActivinA、40-60mM?LY294002、8-12mM尼克酰胺、0.8-1.2×ITS的RPMI1640/B27培養液，在貼壁皿內培養3-4天；0.25％蛋白酶消化，懸浮培養形成EB，更換將上述培養液撤去丁酸鈉、ActivinA和LY294002并添加0.8-1.2×10^-6M?RA、18-22ng/mL?EGF和18-22ng/mL?bFGF的培養液，繼續在常規培養條件下懸浮培養進行初步分化誘導7-9天；在一個優選實施方案中，所述接種培養液還含有1.8-2.2mM?L-谷氨酰胺、0.05-0.15mM?β-巰基乙醇和0.8-1.2mM丙酮酸鈉；

2)將初步分化誘導后的細胞轉移到含有0.8-1.2％?BSA、1.8-2.2mM谷氨酰胺、0.8-1.2mM丙酮酸鈉、22-28μM醋酸鋅、0.8-1.2×ITS、90-110mM煙堿、8-12ng/mL?exendin-4和8-12ng/mL?β-細胞素的RPMI1640/B27培養液上，在常規培養條件下繼續懸浮培養，得到胰島樣細胞團；在一個優選實施方案中，所述培養液還含有1.8-2.2mM?L-谷氨酰胺、0.8-1.2mMβ-巰基乙醇和0.8-1.2mM丙酮酸鈉。

5.權利要求4的方法，其中所述人胰腺干細胞系是依照權利要求1-3任一項的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系。

6.一種使依照權利要求1-3任一項的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系誘導分化成類神經細胞的方法，該方法包括以下步驟：將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于所述培養液B培養20-30h后棄去培養液，添加神經細胞預誘導液處理20-30h后，換成神經細胞誘導液繼續作用8-12h；所述神經細胞預誘導液為Low-DMEM基礎培養液中加入1mmol/L?β-巰基乙醇；所述神經細胞誘導液為Low-DMEM基礎培養液中加入5mmol/L?β-巰基乙醇。

7.一種使依照權利要求1-3任一項的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系誘導成類脂肪細胞的方法，該方法包括以下步驟：將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于上述培養液B培養，待細胞融合度達到80-90％，更換誘導培養基繼續培養，持續培養14～21天；其中所述誘導培養基為Adipogenesis?Differentiation?Kit試劑盒(GIBCO)。