[發明專利]一種檢測人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的方法

無效

• 申請號: 201210444252.4
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN103805682A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 劉青杰;張慶召;張德欽;高玲;封江彬
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于輻射生物劑量估算領域，具體涉及人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的檢測方法。

背景技術

電離輻射對機體的損傷是通過原發作用的直接和間接作用，引起生物分子結構和性質的變化，由分子水平的損傷進一步造成了細胞水平、器官水平和整體水平的損傷，出現相應生化代謝紊亂并由此產生一系列表現或造成死亡和產生某些遠后效應。

在核戰爭和核或放射事故中，大量受照人群的分選和急救是搶救可治愈人群(10Gy以下)的關鍵，而成功的救助需要快速、準確的估算受照劑量。目前估算劑量的方法很多，包括物理的和生物的方法。生物學方法具有其優越性，輻射生物劑量計在核事故受害者受照劑量估算及輻射生物學效應研究中具有重要的應用價值。理想的電離輻射生物劑量計應具備的特點包括：①具有電離輻射可誘導性，特異良好的量-效關系；②確定的劑量和時間響應范圍；③遺傳背景穩定，本底變異較低；④影響、干擾因素明確且可控制；⑤采樣方便，分析方法簡單、迅速、可靠，易于自動化大通量操作；⑥經濟成本和社會成本低等特點。

目前常用的生物劑量計有早熟凝聚染色體片段分析、微核分析、穩定染色體畸變分析、體細胞基因位點突變分析等。但這些技術相對復雜，需要良好的專業知識和訓練后才能夠順利開展，而且在大量人群受到照射的情況下不能滿足高通量檢測、生物輻射劑量快速定量檢測的需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速定量、高通量估算人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的檢測方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種檢測人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的方法，包括如下步驟：

(1)、根據淋巴細胞pig3基因表達序列設計引物和Taqman-MGB探針，構建含有淋巴細胞pig3基因表達序列的重組載體作為標準物質；

(2)、以步驟(1)所述引物和Taqman-MGB探針對10倍系列稀釋的標準物質進行實時熒光PCR，繪制絕對定量標準曲線；

(3)、將正常人外周血中分離的淋巴細胞分組接受不同劑量的電離輻射，按照步驟(2)所述實時熒光PCR的方法對輻射后不同培養時間淋巴細胞pig3基因的表達水平定量測定，獲得輻射劑量和pig3基因表達水平的擬合劑量效應曲線；

(4)、按照步驟(2)所述實時熒光PCR的方法對待測輻射劑量的人外周血淋巴細胞pig3基因的表達水平定量測定，根據步驟(3)所述的擬合劑量效應曲線計算待測淋巴細胞所受的電離輻射劑量。

上述技術方案中，步驟(1)所述的淋巴細胞pig3基因表達序列如SEQ?ID?NO：1；所述引物的上游引物如SEQ?ID?NO：2，下游引物如SEQ?IDNO：3；Taqman-MGB探針序列如SEQ?ID?NO：4，探針的熒光基團為FAM，淬滅基團為NFQ。

本發明提供的檢測人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的方法，是根據人外周血淋巴細胞pig3基因表達序列設計引物及TaqMan-MGB探針，以構建的含有淋巴細胞pig3基因表達序列的重組載體10倍系列稀釋作為標準品模板，在熒光定量PCR儀上進行PCR反應，繪制標準曲線，斜率為-3.4864，相關系數R2＝0.998，呈現很好的線性關系，擴增效率為99.7％。靈敏度檢測結果表明，PCR反應31個循環時可以檢測到的質粒最小濃度是50拷貝數/μL，選用拷貝數50、500、5000、50000和500000/μL?5個濃度梯度質粒做模板，變異系數在1.1％-3.4％范圍內，說明該方法具有良好的重復性和穩定性。本發明通過優化TaqMan-MGB探針熒光定量PCR反應條件和反應體系，能夠快速定量檢測人外周血淋巴細胞pig3基因在接受電離輻射時的表達水平變化，與現有的輻射后早熟凝聚染色體片段分析、微核分析、穩定染色體畸變分析、體細胞基因位點突變分析等方法相比，可以大大的節省時間，達到簡便，快速定量，高通量的要求，在遇到大規模輻照事故時，可以凸顯其優勢。

附圖說明

圖1為標準物質重組pUC57質粒的構建示意圖。

圖2為標準物質重組pUC57質粒瓊脂凝膠電泳圖。

圖3為10倍系列稀釋的標準物質繪制的標準曲線。橫坐標表示基因拷貝數對數值，縱坐標表示Ct值。

圖4為輻射后淋巴細胞培養4、8、12、24和48小時的擬合劑量效應曲線。

具體實施方式