[發明專利]牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的制備及其應用方法

無效

• 申請號: 201210442992.4
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN102944675A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 盧福莊;張雪娟;顧昀;付媛;季敬余;馮尚連;俞國喬;楊玉煥;周煜;陽愛國;董國棟;郭莉;毛光瓊;石團員
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/531
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 沈伾伾

【技術領域】

本發明涉及家畜寄生蟲病的診斷技術領域，具體涉及牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的制備及其應用方法。

【背景技術】

血吸蟲病是人畜共患的寄生蟲病。當前我國尚有7?。ㄗ灾螀^）100多個縣未達到血吸蟲病的傳播控制標準。牛是血吸蟲病的重要傳染源。由于受長江季節性洪水等自然因素及人畜流動頻繁等社會因素的影響，近年來我國血吸蟲病疫情又出現了反復，患病的人畜增加。我國一直來均將血吸蟲病列為動物疫病監測及檢疫的重要對象。因此，對調運家畜的血吸蟲病的過境檢疫、對現疫區家畜的血吸蟲病普查及對歷史上曾經發生過血吸蟲病流行區的牲畜的監測是一項長期而艱巨的任務。因此，研究家畜血吸蟲病快速檢測的方法對防制和消滅血吸蟲病具有重要意義。

目前診斷家畜血吸蟲病的方法主要有糞孵血吸蟲毛蚴法、ELISA法、IHA法和金標免疫滲濾法。糞孵毛蚴法只有在動物感染血吸蟲后5周以上才能糞孵出血吸蟲毛蚴，并且糞便中的蟲卵數量有波動，輕度感染的病畜尤易漏檢，且用糞孵法檢測一個樣品需耗時5～6個小時，隨著勞動力工資大幅上漲，該法在家畜血吸蟲病的普查中已很少被采用。ELISA方法操作繁瑣、時間長、酶試劑難以保存、影響因素多，檢測需專用儀器設備、試驗中使用的某些材料易造成環境污染，對人健康有害。IHA穩定性較差，敏感性不如ELISA法，實驗所需時間也較長。ELISA法和IHA法都不能滿足現場檢疫的要求。金標免疫滲濾法具有檢測速度快、操作簡便不需特殊儀器等特點，適合于血吸蟲病的現場檢疫、診斷和普查。但其診斷試劑為液體，穩定性較差，保存要求高（需4℃冰箱保存），保存期短(僅6個月)，試劑及反應板體積大，郵寄和航空運輸受限，增加了保存、運輸費用及運輸所需的時間。金標免疫層析法可以克服金標免疫滲濾法的這些缺點。國內有數家單位對人血吸蟲病金標免疫層析法進行過研究，但由于各種原因都沒有批量生產和實踐中推廣開來。

從理論上分析，膠體金與抗原或抗體的結合均是通過正負電荷的靜電引力結合在一起的。這種結合的牢固程度容易受溶液pH值和其他離子強度的影響，因此其最適pH范圍往往很小，檢測的可重復性較差。膠體金與抗原或抗體的結合還可能被血液中或試劑中加入的稱作為穩定劑的其它蛋白與膠體金之間競爭性結合的影響，使試劑較快失效或者出現假陽性?？梢哉f這是金標方法本身具有的局限性。

從理論上說，通過共價鍵使分子之間結合的牢固程度要強于由靜電引力結合的強度。乳球免疫層析技術正是繼免疫膠體金技術后新近發展起來的一種以共價鍵結合為特點的免疫標記新技術。本發明的檢測試劑為乳膠微球標記的兔抗黃水牛IgG抗體，乳膠微球與兔抗黃水牛IgG抗體之間以共價鍵結合，所以該復合物穩定性好，且乳膠微球的直徑比膠體金大10～20倍，信號強度大，可提高試劑的靈敏度和陽性樣本的檢出率。

【發明內容】

本發明目的是，針對牛日本血吸蟲病ELISA和IHA診斷法存在操作步驟多、速度慢、不能滿足現場檢疫需求，和金標免疫滲濾法檢測試劑系液體，保存期較短，不能空運或郵寄等缺陷，為牛日本血吸蟲病的診斷、檢疫和普查提供一種敏感、特異、安全、穩定性好、信號強度大，且為固體狀態、沒有污染的檢測試紙條，及在5～15分鐘內即可完成的快速，簡便的檢測方法。

本發明的原理是：采用有機化學方法使紅色或其它顏色的聚苯乙烯乳膠微球羧基化后，使兔抗黃水牛IgG抗體蛋白的胺基與乳膠微球的羧基形成共價鍵，使該染色乳膠微球標記的兔抗黃水牛IgG抗體的結合物作為檢測試劑(免疫探針)；再將該液狀的乳膠微球-兔抗黃水牛IgG抗體結合物以噴霧法使之吸附在聚脂膜上，經烘干成固體狀的免疫探針干片；另以硝酸纖維素膜作為層析膜，并用劃膜噴金儀在該膜的不同位置上畫出血吸蟲卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗體兩條直線，分別作為檢測線（T線）和質控線（C線）；然后按照樣品墊、免疫探針干片、層析膜和吸水濾紙的順序，以頭尾部分重疊的形式裝配在PVC基板上，再貼上箭頭標簽膠膜與手柄標簽膠膜后，用切條機按設定寬度裁切后即成牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條。