[發明專利]牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的制備及其應用方法

無效

• 申請號: 201210442992.4
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN102944675A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 盧福莊;張雪娟;顧昀;付媛;季敬余;馮尚連;俞國喬;楊玉煥;周煜;陽愛國;董國棟;郭莉;毛光瓊;石團員
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/531
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 沈伾伾

1.一種檢測牛日本血吸蟲病抗體的試紙條，其特征在于該試紙條由部件樣品墊、免疫探針干片、層析膜、吸水紙、PVC基板及箭頭標簽膠膜與手柄標簽膠膜組合而成；其中，免疫探針干片是以紅色或其它顏色羧基化聚苯乙烯乳膠微球的羧基，與兔抗黃水牛IgG抗體蛋白的胺基形成共價鍵結合物后作為免疫探針的檢測試劑液吸附于聚脂膜后制成；層析膜是以硝酸纖維素膜為膜基，用劃膜噴金機將血吸蟲卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗體分別在該膜上畫出檢測T線和質控C線而成；先將上述前四部件按頭尾部分重疊粘合裝配在PVC基板上，再將箭頭標簽膠膜粘貼在免疫探針干片上，另將手柄標簽膠膜粘貼在吸水紙上后，用切條機按設定寬度裁切后即成牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條。

2.一種制備權利要求1所述牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的方法，其特征在于按以下步驟進行：

（1）免疫探針干片的制備：包括

1）兔抗黃水牛IgG的制備：

①?黃水牛IgG的制備：采集健康黃牛、水牛血液，分別分離血清后取血清各5ml混合，加等量0.85%?NaCl，用30%硫酸銨沉淀法提取黃水牛IgG，沉淀的黃水牛IgG用原血清體積2倍量的0.85%?NaCl溶解，再用35%硫酸銨沉淀法重復提取2次，最后用5ml?0.85%?NaCl溶解離心沉淀的黃水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH₄⁺及SO₄^2-后，再用蒸餾水稀釋或將透析袋放入PEG中濃縮的方法，調節蛋白濃度至10mg/ml后，于-20℃密封貯存備用；

②?黃水牛IgG免疫兔：將黃水牛IgG與弗氏完全佐劑按體積3:7比例制成油乳劑，按黃水牛IgG?6mg/只兔用量，對體重2.5kg的健康雄性家兔，在兔頸部皮下和兔雙側后足蹠墊皮下注射進行首次免疫；后除用弗氏不完全佐劑替代弗氏完全佐劑外，再按上述同樣配比、方法，每隔兩周進行一次加強免疫，共進行三次；第4次后10天，取耳靜脈少量血分離血清，用瓊脂擴散法測定免疫血清效價，當血清效價≥1:64時，即可心臟大量釆血、分離血清后，備用；

③?兔抗黃水牛IgG抗體的制備：取兔抗黃水牛IgG血清10ml，以35%硫酸銨沉淀法提取兔抗黃水牛IgG抗體，以2倍于血清量的0.85%?NaCl溶解沉淀的兔抗黃水牛IgG抗體，如此反復提取3次后，將第3次硫酸銨沉淀的兔抗黃水牛IgG抗體的離心沉淀物以5ml?0.85%?NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH₄⁺及SO₄^2-；在蛋白測定儀上測定兔抗黃水牛IgG抗體蛋白含量后，用pH7.20?0.1M的硼酸緩沖液稀釋或將透析袋放入PEG中濃縮的方法，將蛋白濃度調節至4mg/ml后，于-20℃密封貯存備用；

2）乳膠微球的洗滌：將直徑200nm紅色或其它顏色的聚苯乙烯乳膠微球液，在10000?rpm，4℃條件下離心10min，去上清液，沉淀物用高純水還原為原體積，用超聲波分散沉淀的乳膠微球成為均勻懸浮液后，再用上述相同的方法重復離心、重懸浮1～2次；

3）乳膠微球羧基的激活：將pH6.5?0.1mol?MES，10%帶色乳膠微球的懸液，20mg/mL的EDC·HCl和20mg/mL的NHS，按體積9:2:1:0.75的比例混合、反應2hr；然后在11000?rpm?4℃條件下離心25min，除去上清液，沉淀物以所用帶色乳膠體積5倍量的pH7.20?0.1M的硼酸緩沖液重懸，以超聲波擊打還原成均勻的懸浮液；用垂直混合儀混合15min，在11000?rpm，4℃條件下離心25min?除去上清液，沉淀物以所用帶色乳膠體積2.5倍量的pH7.20?0.1?M的硼酸緩沖液重懸，以超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，即為羧基活化的乳膠微球；

4）乳膠微球標記兔抗黃水牛IgG抗體：往裝有羧基活化乳膠微球懸浮液的離心管中加入等體積以pH7.20?0.1M的硼酸緩沖液稀釋成蛋白濃度為1～4mg/mL的兔抗黃水牛IgG抗體，在垂直混合儀上混合反應2hr以上；再加入總體積十分之一量的20%BSA?振蕩反應1hr，反應后的混合物以11000?rpm?4℃離心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白0.2%～0.5%、蔗糖5%～10%、NaN₃?0.02%～0.05%的?pH7.2?0.05M?Tris-HCl緩沖液構成的封閉液原體積重懸，超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，在垂直混合儀上混合15min，再次以11000rpm?4℃離心25min，除去上清液，沉淀物以相當于乳膠微球懸浮液和兔抗黃水牛IgG抗體兩者總體積75%的同上封閉液重懸，超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，該液即為紅色或其它顏色的免疫探針檢測試劑液；

5）免疫探針干片的制備：將上述的免疫探針檢測試劑液用劃膜噴金機以2～5μl/cm的流速噴涂在已經過含酪蛋白0.2%～0.5%，蔗糖5%～10%，NaN_3?0.02%～0.05%,Tween-20?0.2%～0.5%的pH7.2?0.05M?Tris-HCl緩沖液構成的聚酯膜處理液預處理后的長300mm×寬8.5mm的聚酯膜上，經37℃,1hr烘干，即為免疫探針干片；

（2）層析膜的制備：

????1）血吸蟲卵可溶性抗原的制備：按體重2.5～3kg的健康新西蘭兔，每只接種血吸蟲尾蚴2000條，實驗感染兔于接種后45日屠宰取肝臟，分離和純化血吸蟲蟲卵，經冷凍干燥后研磨破碎，用0.85%NaCl溶液配成3%～5%懸浮液，2～8℃浸泡3日，再反復凍融10次，冰浴超聲波破碎30min，10000r/min離心1hr，取上清液，裝透析袋，用pH7.0?0.01M?PB透析16小時，每隔4小時換透析液1次，透析結束后，以10000rp離心60min，上清液即為血吸蟲卵可溶性抗原；檢測其蛋白含量后，用pH8.2～8.5?0.05M?TBS稀釋至1～7mg/mL濃度，即可用于層析膜上檢測T線的繪制；

2）羊抗兔IgG的制備：

①兔IgG的制備：以心臟采血法采集健康新西蘭兔的血液，分離血清，取兔血清10ml，再加10ml?0.85%?NaCl混勻，用35%硫酸銨沉淀法提取兔IgG，反復沉淀提取3次，沉淀物用5ml?0.85%?NaCl溶解后，用透析法除去硫酸銨，并在蛋白測定儀上測定兔IgG的蛋白含量；

②羊抗兔IgG抗體的制備：用弗氏佐劑將兔IgG溶液配制成1mg/ml，用超聲波制成乳濁液；按照每千克體重2mg的劑量皮下注射免疫羊，每間隔2周，再用弗氏不完全佐劑和兔IgG制備成相同濃度的乳濁液，以相同劑量與方法免疫羊，第3次免疫后10d頸靜脈采血分離血清，以瓊脂免疫擴散法測定血清中羊抗兔IgG抗體效價≥1:32以上時，即可大量采集羊血并制取血清；

分離羊抗兔IgG抗體先用30%硫酸銨沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗體一次，再用45%硫酸銨沉淀法提取2次，離心沉淀物用5ml?0.85%?NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH₄⁺及SO₄^2-，3000rpm離心30min，檢測上清液蛋白含量后，用pH8.2～8.5?0.05M?TBS將上清液稀釋成0.1～2mg/mL的濃度，即可用于層析膜上質控C線的繪制；

3）檢測線和質控線的制作：將長25mm×寬300mm的硝酸纖維素膜放在劃膜噴金機的操作平臺上，在該機1#泵的試劑瓶中加入血吸蟲卵可溶性抗原，2#泵的試劑瓶中加入羊抗兔IgG，以1～3μl/cm的流速，在硝酸纖維素膜上劃出檢測T線和質控C線，兩線相距5～6mm，置室內晾干即為層析膜；

（3）樣品墊的制備：將23mm×300mm玻璃纖維膜在由含酪蛋白0.01%～0.05%,蔗糖5%～10%、NaN_3?0.02%～0.05%和Tween-20?0.2%～0.5%的pH7.2?0.04M?Tris-HCl緩沖液構成的樣品墊處理液中浸泡1hr，取出，37℃烘干即成；

（4）吸水紙的制備：CH37吸水紙裁成長300mm×寬28mm的紙條，置37℃烘干即成；

（5）PVC基板的制備：PVC板其結構為三層，第一層為保護紙，第二層為不干膠，第三層為PVC基板；在保護紙上刻有三條刻痕，分別位于距離一側長邊的20mm、27mm和53mm處；將PVC板按長300mm×寬80mm規格裁剪后備用；

（6）標簽膠膜的制備：用不干膠貼紙印制而成；其中，

????1）箭頭標簽膠膜：其規格為長300mm×寬18mm，在距一側長邊1mm處印有一條直線，在該直線的上方，每隔1.3mm印有一條“←MAX”字樣，箭頭與直線垂直；指示試紙條樣品墊可浸入待測溶液的最大深度不得超過這條直線；

????2）手柄標簽膠膜：其規格為長303mm×寬30mm，綠底白字，與長邊呈15°夾角印有4列“SjAb”字樣，SjAb為Schistosoma?japonicum?Antibody的縮寫，表示該試紙條用于檢測日本血吸蟲抗體，該部位為試紙條拿取時的手柄部位；

（7）試紙條各部件的組裝、切條、包裝和貯存：

????1）試紙條各部件的組裝：試紙條以長300mm×寬80mm的PVC為基板，依次將300mm?×23mm的樣品墊、300mm×8.5mm的免疫探針干片、300mm×25mm的層析膜及300mm×28mm的吸水紙，按頭尾各有1～2mm的重疊連接、粘貼在帶不干膠面的PVC基板上；再在吸水墊的尾部與免疫探針干片上粘貼上箭頭標簽膠膜；另在樣品墊上粘貼上手柄標簽膠膜；各部件壓平，粘貼牢固即成試紙條大卡；

????2）切條：將試紙條大卡放在切條機上，按3mm寬度連續切割，即成寬3mm×長80mm的試紙條；

????3）包裝與貯存：試紙條抽檢合格后，按包裝規格要求裝入鋁箔袋中，放入1小包干燥劑后，封口，即成產品；在?2～8℃保存，有效期為12個月。

3.應用權利要求1所述試紙條檢測牛日本血吸蟲病抗體的方法，其特征在于按以下步驟進行：

（1）血清稀釋液的配制：將Na₂HPO_4、KH₂PO_4、NaCl與蒸餾水按重量體積0.199g∶0.082g∶1g∶200ml比例混合，37～40℃水浴加熱溶解、冷卻后即成血清稀釋液；

（2）待檢牛血清的稀釋：將待檢牛血清與血清稀釋液按體積1:1～2比例混合稀釋；

（3）檢測操作：吸取稀釋的待檢血清0.05ml滴在平放的試紙條的樣品墊上，或將試紙條的樣品墊端插入待檢稀釋血清中至箭頭標簽膠膜所印的直線條15s后，平放在操作臺面上；

（4）結果判定：5～15min后觀察結果，檢測T線和質控C線均呈現紅色或其它顏色的同色條帶，則判為陽性；僅質控C線呈現1條紅色或其它顏色的條帶，則判為陰性；檢測T線和質控C線均不呈現條帶，則說明該試紙條已失效或試驗操作有誤。