[發明專利]一種通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法

在審

• 申請號: 201210441697.7
• 申請日: 2012-11-08
• 公開（公告）號: CN102911964A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 曹言勇;李會勇;李晶晶;王利鋒;張永輝;王浩
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法。

背景技術

轉基因植物是指采用基因工程手段將從不同生物中分離或人工合成的外源基因在體外進行酶切和連接，構成重組DNA分子，通過微生物介導、人工原生質體、顯微注射以及基因槍轟擊等方法，直接導入到植物體細胞內或組織中，使新的基因在植物細胞或組織內整合、表達，并能通過無性或有性增值過程，將外源基因遺傳給后代，由此獲得基因改良植物，使之穩定遺傳并賦予植物新的農藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產、優質等。這一技術克服了植物有性雜交的限制，使基因交流的范圍無限擴大，可將從細菌、病毒、動物、遠緣植物、人類甚至人工合成的基因導入植物，所以其應用前景十分廣闊(Twyman，2003；Walmsley，2000)。轉基因植物技術及其產品是當今世界農業生物技術研究與產業化開發的重點和熱點，是我國農業科技革命的核心內容之一，對我國農業科技手段的更新換代以及農業產業結構的調整具有重要的戰略意義。隨著現代生物技術的迅速發展，植物轉基因技術方興未艾，因而對它的研究意義也顯得尤為重要。

1986年Fromm等(1986)利用電擊法首次將抗除草劑pat基因轉入玉米原生質體中，獲得了穩定整合和表達的愈傷組織，實現了玉米遺傳轉化的重大突破，但是沒有獲得轉化植株。1988年Rhodes等(1988)首次獲得玉米轉基因完整植株，隨后Prioli等(1989)、Shillito等(1989)、Fromm等(1990)分別于1989年和1990年報道獲得了可育的玉米轉化植株。

到目前為止，世界轉基因玉米研究已經從轉化方法的探索發展到商品化階段。在短短20年的時間里，玉米轉化受體、轉化方法以及目的基因應用等各方面的研究都取得了迅速發展。

玉米遺傳轉化的方法按其是否需要通過組織培養、再生植株可分成兩大類，第一類需要通過組織培養再生植株，常用的方法有農桿菌介導轉化法、基因槍法；另一類方法不需要通過組織培養，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。

農桿菌介導的遺傳轉化過程主要包括5個步驟(顧紅雅，1997)：(1)細菌在植物敏感細胞上吸附；(2)農桿菌中Ti質粒的vir區被激活；(3)T-DNA的切割和T-DNA復合物的形成；(4)T-DNA復合物由農桿菌進入植物細胞；(5)T-DNA整合到染色體上并進行表達。

選擇和建立良好的植物受體系統是基因轉化能否成功的關鍵因素之一。所謂植物基因轉化受體系統，是指用于轉化的外植體通過組織培養途徑或其它非組織培養途徑，能高效、穩定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統。目前用于玉米基因轉化的受體系統主要有以下幾種：

(1)胚性愈傷組織

1949年LaRue(1949)用甜玉米的胚乳作外植體首次誘導出愈傷組織，但最終未獲得再生植株。直到Green等(1975)用A188的幼胚作外植體，誘導出二倍體愈傷組織，并獲得再生植株，從此，玉米組織培養技術不斷完善。愈傷組織由外植體誘導形成，有兩種類型，大多數玉米自交系易形成致密的I型愈傷組織，這種愈傷組織胚性差，繼代后較難再生出植株；另一種松脆的II型愈傷組織生長迅速，可以長期繼代保持胚性，便于產生胚性懸浮細胞系，繼而制備原生質體，雖然玉米II型愈傷組織的誘導受到基因型的影響，但其仍是目前玉米轉化的常用受體，具有較高的轉化頻率和再生頻率。愈傷組織多是以幼胚作外植體誘導產生而來，比較容易獲得，再生能力較強，獲得轉化植株的周期相對較短，仍然是目前應用最廣泛的受體材料。Huang等(2004)利用成熟胚建立高效的再生體系時也在成熟胚中獲得了較高的胚性愈傷組織發生率，因此對便于操作的成熟胚進行研究，誘導胚性愈傷組織可能有會建立理想的轉化受體系統。

由于胚性愈傷組織再生能力較強，容易大量繁殖，獲得轉化植株的周期較短，是目前應用最廣泛的受體材料之一。但是，從外植體誘導的愈傷組織常是由多細胞形成，本身就是嵌合體，因而分化的不定芽嵌合體比例更高，這就使篩選轉基因再生植株的難度加大。再者，愈傷組織所形成的再生植株無性系變異較大，轉化的外源基因遺傳穩定性較差，為了克服這種困難，有人提出幾種方法，如借助非轉化正常植株的花粉授粉、延長生長過程、使其盡量減少變異等。

(2)幼胚